HCV蛋白NS5A在胰岛素信号通路中的作用

摘要

研究背景
　　 丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus，HCV)是一种主要经过血液传播的嗜肝性病毒，其慢性感染可引起慢性丙型肝炎，进而可导致肝硬化或肝细胞癌。据WHO统计，全球丙型肝炎病毒(HCV)感染者约1.7亿（感染率约为3％），我国HCV感染率为3.2％，且感染率仍有逐年上升的趋势。然而HCV感染治疗的手段有限，主要依靠α-干扰素，及以α-干扰素为主体再附加其他辅助手段。目前也还没有有效疫苗，使得HCV感染成为一个重要的社会问题。尽管科学研究受到广泛的重视，但HCV感染的分子机制还有许多不清楚，从而影响了临床丙肝病毒感染的治疗手段的发展。
　　 HCV属黄病毒科丙型肝炎病毒属。HCV编码多个结构蛋白和非结构蛋白，其中NS5A是一个重要的非结构蛋白。它有两种磷酸化形式:p56和p58，它们均可以与宿主内多种信号蛋白发生作用。近来的研究发现NS5A与胰岛素信号通路（Insulin/PI3K/Akt通路）之间存在关联。而胰岛素信号通路在细胞代谢、细胞周期调控、细胞生长凋亡等多种生物学过程中发挥着重要的作用。这意味着NS5A可能通过改变胰岛素信号通路，从而在HCV感染过程中发挥其作用。在正常情况下这条信号通路受到严格的调控，其稳态的变化与不同疾病的发生相联系。当Insulin/PI3K/Akt信号通路中的关键分子PI3K（调节亚基p85和催化亚基p110）、Akt等编码基因的功能发生改变，可导致细胞代谢障碍[2-3]、细胞周期及细胞生长凋亡紊乱而引起各种疾病，例如肿瘤。HCV蛋白NS5A可结合并激活PI3K，导致下游分子丝氨酸/苏氨酸激酶，即Akt/蛋白激酶B的激活，破坏了信号通路在体内的稳态，导致HCV感染的细胞持续增殖而引发一系列病理效应，包括抗病毒抗性的产生[4-5]、肝细胞癌发生等[6-7]。
　　 PTEN是除p53之后一个重要的抑癌基因。该基因功能的降低与多种组织的肿瘤发生有关。曾有研究报道丙肝导致的肝癌中，PTEN的功能降低。而PTEN是胰岛素信号的主要负调节因子，抑制Insulin/PI3K/Akt信号，从而与HCV激活Insulin/PI3K/Akt信号作用相对抗。本论文研究了抑癌基因PTEN与细胞胰岛素信号通路稳态的关系，及HCV蛋白NS5A对细胞胰岛素信号通路稳态的破坏作用，显示了PTEN与NS5A从正反两个方面影响胰岛素信号通路，通过改变该信号通路的稳态，从而影响细胞的命运。
　　 第一部分PTEN对Insulin/PI3K/Akt信号通路稳态的作用
　　 [目的]
　　 既然，丙肝肝癌中，PTEN的功能减弱。因此，我们首先研究PTEN与Insulin/PI3K/Akt稳态的关系。我们以人肝癌细胞系HepG2为研究模型，用胰岛素刺激、或上调或沉默PTEN的表达等，利用Westernblot技术，从蛋白水平层面研究Insulin/PI3K/Akt信号通路的稳态变化。
　　 [方法]
　　 1、常规培养HepG2细胞传代均匀铺十二孔板，待长至约90％后，予血清饥饿24小时后裂解细胞。裂解细胞前予insulin刺激10min（胰岛素工作浓度为2ul/ml，用无血清DMEM液稀释）或加入同体积的无血清DMEM培养液作对照，分为insulin刺激组或control组，裂解细胞提取总蛋白，Westernblot蛋白分析法检测p-Akt蛋白表达水平。
　　 2、常规培养的HepG2细胞根据转染携带人野生型PTEN的真核表达质粒(pSvEGFP-PTEN)或磷酸酶域突变型质粒pSvEGFP-C124S两种不同质粒分为两组，即PTENwt组及PTENC124S组，转染、血清饥饿同上。两组均予等量等浓度胰岛素刺激10min后裂解细胞，提取总蛋白。Westernblot蛋白分析检测p-Akt蛋白表达水平。
　　 3、常规培养的HepG2细胞根据转染PTENsiRNA及其controlsiRNA分为两组，即PTENsiRNA组及control组，转染、血清饥饿及胰岛素刺激同上。转染共48小时后常规裂解细胞，提取总蛋白。Westernblot蛋白分析法检测PTEN及p-Akt两种蛋白表达水平。
　　 4、所有结果经Excel2010及SPSS13.0统计软件分析，数据以“算术平均值±标准误（M±S.E.M）”表示。两组间比较采用独立样本t检验(Independent-SamplesTTest)或两个独立样本比较的Wilcoxon秩和检验，以P值＜0.05视为有显著性差异。
　　 [结果]
　　 1、Westernblot检测结果显示insulin刺激组较control组p-Akt蛋白表达水平显著提高(P＜0.010)，Westernblot以β-actin作内参，两组灰度比值比分别为0.221±0.136及0.000±0.000。
　　 2、Westernblot检测结果显示PTENC124S组较PTENwt组Akt磷酸化水平有所提高(灰度比值比分别为0.360±0.141和0.084±0.055，P＜0.05)。
　　 3、Westernblot检测结果显示PTENsiRNA组比control组HepG2细胞PTEN蛋白表达水平偏低(P＜0.05)，相应的p-Akt蛋白表达水平却相对显著提高(P＜0.005)。
　　 [结论]
　　 1、胰岛素可以诱导Insulin/PI3K/Akt信号通路的激活。
　　 2、当Insulin/PI3K/Akt信号通路中某一环节如负调控因子PTEN基因点突变或敲低，可引起下游信号分子Akt活化。
　　 3、在正常情况下Insulin/PI3K/Akt信号通路受到严格的调控，外源性干预使信号通路中任一环节受阻或失控，这一稳态将被打破，或过度抑制或过度激活。
　　 第二部分HCV蛋白NS5A在Insulin/PI3K/Akt信号通路中的作用
　　 [目的]
　　 上一部分显示，PTEN对Insulin/PI3K/Akt稳态的作用。接着，我们研究NS5A对Insulin/PI3K/Akt的影响。我们将丙肝病毒NS5A质粒导入Insulin/PI3K/Akt信号通路活跃的人肝癌细胞系HepG2细胞中，从蛋白水平探求丙肝病毒(HCV)蛋白NS5A对于PI3K/Akt通路的调控作用及其初步机制，为临床上丙肝慢性迁延、肝细胞癌发生及抗病毒抗性等方面提供依据。
　　 [方法]
　　 1、HepG2细胞分别转染NS5A质粒或对照空载体，转染相应质粒24小时后血清饥饿。转染共48小时后胰岛素刺激10min即常规裂解细胞提取总蛋白。以p-Akt抗体为一抗，Westernblot检测Akt磷酸化水平。
　　 2、常规培养的HepG2细胞根据转染NS5A质粒或对照空载体两组不同质粒分为NS5A组及control组，转染48小时后常规裂解细胞提取总蛋白。采用免疫沉淀法检测:将NS5A组或control组HepG2细胞总蛋白先与PI3K调节亚基p85多克隆抗体进行免疫沉淀，再以anti-pTyr为Westernblot抗体检测，比较两组间p85酪氨酸磷酸化水平。
　　 3、常规培养HepG2细胞根据转染NS5A质粒或对照空载体两组不同质粒分为NS5A组及control组，转染48小时后常规裂解细胞提取总蛋白。采免疫共沉淀法检测:将NS5A组或control组HepG2细胞总蛋白先与PI3K催化亚基p85多克隆抗体进行免疫沉淀，再以anti-p110为Westernblot抗体检测，比较两组间催化亚基p110与调节亚基p85的结合水平。
　　 4、所有结果经Excel2010及SPSS13.0统计软件分析，数据以“算术平均值±标准误（M±S.E.M）”表示。两组间比较采用独立样本t检验(Independent-SamplesTTest)或两个独立样本比较的Wilcoxon秩和检验，以P值＜0.05视为有显著性差异。
　　 [结果]
　　 1、Westernblot检测结果显示NS5A质粒转染组HepG2细胞p-Akt蛋白水平较control组明显上调(灰度比值比分别为0.811±0.131及0.205±0.066，P＜0.002)。
　　 2、免疫沉淀法检测到NS5A质粒转染组的p85酪氨酸磷酸化水平较control组的高（灰度比值比分别为1.055±0.189及0.479±0.147，＜0.014）。
　　 3、免疫共沉淀法检测结果显示NS5A质粒转染组与control组细胞的p85和p110蛋白结合无差异（灰度比值比分别为0.543±0.286及0.195，P＞0.05）。
　　 [结论]
　　 HCV蛋白NS5A可以与PI3K调节亚基p85蛋白相互作用，进而激活Insulin/PI3K/Akt信号通路，但HCV蛋白NS5A与p85蛋白间的相互作用并没有影响到PI3K调节亚基p85和催化亚基p110间的结合。HCV蛋白NS5A激活PI3K信号通路，可能不是通过经典途径发生，而是通过其他途径。这可能提示着，HCV对胰岛素信号通路的影响的另一机制，正是通过影响PTEN的途径。

目录

摘要

前言

第一部分 PTEN对Insulin／PI3K／Akt信号通路稳态的作用

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

第二部分 HCV蛋白NS5A在胰岛素信号通路中的作用

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

小结

参考文献

中英文缩略词对照表

在读期间已经发表和将要发表的论文

致谢

声明

统计学审稿证明