Synaptotagmin1影响小鼠卵母细胞纺缍体组装和稳定及中后期转换过程的研究

摘要

Synaptotagminl(Syt1)作为钙离子感受器，与SNAP-25，syntaxin和synaptobrevin一起构成7S或者所谓的SNARE蛋白复合体，用于调节神经末梢胞膜与神经突触囊泡的锚定和融合，引起胞内钙离子浓度升高诱导神经囊泡内神经颗粒的胞吐发生。Syts是由一组结构相关的家族蛋白组成，从脊椎动物到人类高度保守于各类组织中。Syt1和Syt2在神经组织丰富表达，尤其Syt1在神经和分泌囊泡膜富集，在外源刺激作用下，结合胞内钙离子诱导神经递质和分泌颗粒的胞吐。但是到目前为止，关于Syt1在生殖细胞中的功能研究很少，尤其与卵母细胞骨架相关。本课题中，我们深入地研究了Syt1在小鼠卵母细胞发育过程中的亚细胞定位及可能发挥的作用。免疫荧光标记证明Syt1定位主要集中分布在MⅠ和MⅡ期纺锤体的两极，这些可能与Syt1在小鼠卵母细胞成熟过程中所行使的功能有关，并且证实了Syt1在MⅠ和MⅡ期与中心体相关蛋白γ-tubulin共定位。另外在卵母细胞各时期集中于皮质区、部分分散于胞浆，在MⅠ和MⅡ期皮质区有1/3靠近染色体的无定位区域（类似于卵母细胞皮质颗粒的分布特征），此亚细胞定位可能与Syt1对小鼠卵母细胞皮质颗粒的胞吐和受精功能有关（数据未列出）。紫杉醇处理卵母细胞后发现上述Syt1的定位与纺缍体的组装相关。紫杉醇试验后微管高度集中，在胞内产生很多星体，免疫荧光观察发现Syt1集中定位于星体和高度集中的微管两极。在小鼠卵母细胞内注射Syt1特定寡聚核苷酸（morpholino），它能与Syt1的mRNA或（和）DNA结合，特异性抑制其转录或（和）翻译，降调其表达水平，注射前后免疫印迹试验证实了这一点。降调Syt1表达后，我们发现纺缍体组装异常比例升高，且多数为无极、单极或者多极纺缍体，其次有拉长纺锤体和形态各异纺锤体;染色体排列异常;第一极体排出率下降，并影响微管组织中心相关蛋白γ-tubulin的正确定位。另外小鼠卵母细胞减数分裂进程受到阻碍，染色体铺片和纺锤体检验点蛋白试验发现Syt1降调后后期染色体相对于对照组染色体未能完成正确分离并激活了后期纺锤体检验点蛋白的活性，说明Syt1对小鼠卵母细胞减数分裂中后期转换进程起着重要的作用。为了进一步深入研究降调Syt1后引起的卵母细胞及其对分裂成熟进程影响的缺陷，我们向卵母细胞内注射了β5-tubulin-GFPmRNA，H2B-RFP mRNA和Syt1-MO的混合物，并应用活细胞工作站延时拍摄系统去捕捉纺缍体、染色体和卵母细胞分裂进程在降调了Syt1后的的动态变化。结果证实了降调Syt1会影响卵母细胞纺缍体的迁移，纺缍体极的形成和稳定;染色体阻滞在第一次分裂前中期或者中期(Pro-MⅠ/MⅠ);形态异常的纺锤体不能发挥正常功能，使染色体不能沿微管正常排列，导致卵母细胞不能完成中后期转换且反复分离失败和第一极体不能释放。总之，实验结果表明:Syt1在卵母细胞减数分裂成熟的不同阶段有不同的特异性定位，其定位主要集中分布在MⅠ和MⅡ期纺锤体的两极，这些可能与Syt1在纺锤体的组装和稳定、染色体的排列、减数分裂中后期转换和第一极体释放的作用有关，它可能作为一种微管组织中心蛋白监控纺锤体状态或者调控与纺锤体组装和稳定相关的蛋白;Syt1参与调控卵母细胞的减数分裂中第一次分裂中后期转换和第一极体的释放。另外在卵母细胞各时期集中于皮质区、部分分散于胞浆，而且在MⅠ和MⅡ期皮质区有1/3靠近染色体的无定位区域。这些亚细胞定位可能与Syt1对小鼠卵母细胞皮质颗粒的胞吐和受精功能有关（数据未列出）。
　　 本研究分两部分进行:
　　 一、Syt1可能作为微管组织中心相关蛋白调节小鼠卵母细胞纺缍体的组装或稳定
　　 [目的]
　　 确定Syt1对小鼠卵母细胞纺缍体组装和稳定的影响。
　　 [研究方法]
　　 卵子的收集和培养:
　　 本实验采用4-6周龄ICR品系雌性小鼠，断颈法快速处死小鼠后取出卵巢，盛于一次性培养皿中，用刀片将卵巢剁碎，释放出来停留在第一次减数分裂间期的未成熟卵母细胞。只将处于GV期的未成熟卵母细胞转移至M2培养滴中，清洗5-6次后，移至覆盖有矿物油的M16培养滴或者含有2.5μM milrinone的M16培养滴，置于培养箱中培养（37℃，5％ CO2，95％湿度）。培养到不同时期后取出用于免疫印迹、免疫荧光及药物处理。
　　 Taxol处理卵子:
　　 用M16培养液稀释Taxol至10μmol/ml，待卵子发育至特定时期后，移至含Taxol的M16培养滴，于培养箱中孵育45分钟，之后，将卵母细胞彻底洗净用于免疫荧光实验。对照组中卵母细胞用相同浓度的DMSO进行处理。
　　 免疫荧光及激光共聚焦显微镜检测:
　　 卵母细胞放入含4％多聚甲醛的PBS中室温30分钟。在室温下0.5％TritonX-100透膜20分钟，卵母细胞采用添加1％BSA的PBS室温封闭1小时，然后加入1:200的兔抗Syt1抗体，1:200的兔抗γ-tubulin抗体，1:200兔抗α-tubulin抗体或1:100 anti-α-tubulin-FITC抗体放入4℃冰箱过夜。第二天采用含0.1％Tween20和0.01％Triton X-100的PBS中洗三次，每次5分钟。卵母细胞在室温下标记上1:100的FITC/TRICT/CY5羊抗兔IgG，或1:100的FITC/TRICT/CY5羊抗鼠IgG1小时。之后采用Hochest或PI标记8-15分钟，再洗涤三次。最后卵母细胞移到载玻片上采用激光共聚焦扫描显微镜(Zeiss LSM510或者Zeiss LSM710 META）检测。每组实验最少重复三次，每组至少检测50个卵母细胞。
　　 免疫印迹:
　　 收集待检测的卵子约200个，加入等体积2×SDS loading buffer置于沸水中5分钟，冰上冷却后瞬时离心，存于冰上或-20℃。微量加样器上样，恒压90V电泳至样品位于浓缩胶边缘，改为恒压120V电泳2.5小时;4℃条件下转膜，恒流200mA2.5小时，蛋白转至硝酸纤维素膜;TBS(20mM Tris，137mM NaCl，pH7.4)清洗膜三次，每次10分钟;膜转至封闭液中(5％脱脂奶粉/TBST)室温放置1.5小时;TBST(10mM Tris，150mM NaCl,0.05％ Tween20，pH7.5)清洗三次，每次10分钟;膜移至封闭液稀释的一抗中4℃放置过夜;TBST清洗三次，每次10分钟;膜移至封闭液稀释的二抗中37℃放置1小时;TBST清洗三次，每次10分钟;SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate kit(Thermo)检测信号。重复标记时，膜移至洗脱液(β-mercaptoethanol14.3M，2％ SDS，62.5mM Tris，pH6.7)中50℃放置30分钟，依照上述方法重新与相应的一抗、二抗孵育。本实验涉及到的抗体采用效价如下:兔抗Syt11:1000，鼠抗β-actin1:1000，抗鼠IgG1:1000。
　　 Morpholino注射:
　　 Morpholino是经过修饰的人工合成反义寡核苷酸链小分子，与目的基因的mRNA或/和DNA结合，特异性抑制基因的转录或/和翻译，可作为研究基因功能的小分子工具。本实验所用morpholino购自GENE TOOLS公司，Syt1-morpholino序列信息如下:5’-GACTGGCACTCACCATTTTTGGTTC-3';Control-morpholino序列信息如下:5’-CCTCTTACCTCAgTTACAATTT ATA-3。用Sigma水稀释成储存浓度为2mM和4mM。注射5-10pl的1mM MO后卵母细胞在含2.5μM的Milrinone中培养24小时。新鲜M2培养液中洗5遍，移到新鲜M16培养液中继续培养8小时和12小时，收集这两个时段的卵母细胞固定后做荧光免疫共聚焦试验。
　　 [结果]
　　 小鼠卵母细胞减数分裂过程中Syt1的表达和亚细胞定位:
　　 体外培养小鼠卵母细胞0小时、2小时、4小时、8小时、10小时和12小时分别对应其发育阶段的GV、GVBD、Pro-MⅠ、MⅠ、A(Ⅰ)和MⅡ期，用免疫印迹法半定量检测GV、MⅠ和MⅡ期的蛋白表达水平。结果显示在小鼠卵母细胞发育各时期均有Syt1的表达。为了检测Syt1在小鼠卵母细胞发育不同时期的亚细胞定位我们采用了免疫荧光法。Syt1主要集中分布在皮质区，部分散在分布于胞质，尤其从Pro-MⅠ到MⅡ期的卵母细胞，染色体靠近的1/3皮质区域没有Syt1的荧光信号。上述分布特点类似卵母细胞皮质颗粒的分布。到了减数分裂中期(MⅠ)和(MⅡ)，可以明显地看到Syt1主要聚集在纺缍体的两极。Syt1定位于小鼠卵母细胞纺缍体两极现象使得我们思考:是否Syt1与其它的中心体相关蛋白如γ-tubulin有共定位？我们的研究表明在MⅠ和MⅡ期，Syt1的信号与γ-tubulin相重叠，进一步证实了Syt1在两极定位的现象。
　　 紫杉醇处理后Syt1的定位:
　　 我们用了微管聚集药物紫杉醇处理小鼠MⅠ期卵母细胞，以明确Syt1与微管动力的关系。当把10μmol/ml的紫杉醇加入培养液处理45分钟，可以发现纺缍体微管高度聚集并在胞内形成大量星体，Syt1的定位也发生了变化，集中定位于聚集的微管两极和星体上，说明Syt1参与微管纺锤体的组装。
　　 降调Syt1对MⅠ期和MⅡ期纺缍体组装和染色体排列的影响:
　　 为了进一步明确Syt1在小鼠卵母细胞发育过程中的作用，我们采用Syt1的特异性反义寡核苷酸MO注射。免疫印迹图显示MO注射后，Syt1表达水平明显下降。GV期的卵母细胞注射MO后在含有2.5mM的米力侬的M2培养液中抑制24小时，然后释放，转移到M16培养液中继续培养，8小时和12小时后收集MⅠ和MⅡ期卵子。在Syt1-MO注射组，卵母细胞出现了各种形态异常的纺缍体和排列紊乱的染色体。异常纺锤体主要是极体异常的纺缍体，包括无极、单极、多极;其他异常的类型有拉长和未组装好的纺缍体。染色体异常主要表现为延迟分离和完全排列紊乱。Syt1-MO注射组卵母细胞纺锤体和染色体异常率分别为79.23％和63.90％(n=130)，显著高于对照组，x2值分别为70.594和34.507，P值均为0.000。
　　 降调Syt1的表达导致γ-tubulin从纺缍体的两极脱落:
　　 从上面结果我们可以推断Syt1参与了纺缍体组装和极的聚集。我们以前的研究表明，在小鼠卵母细胞减数分裂中，中心体蛋白γ-tubulin，是微管组装和纺缍体形成的重要调节因子。通过MO注射降调Syt1的表达，我们发现γ-tubulin的定位也受到了影响，均从纺缍体的两极脱落下来，散落在缍缍体微管上或胞浆中。
　　 [结论]
　　 在小鼠卵母细胞减数分裂过程中，Syt1参与了微管的组装，进而影响到染色体排列，并且可能是作为一种微管组织中心相关蛋白，与其它中心体相关蛋白相互作用共同调节纺缍体的组装。
　　 二、Syt1调控小鼠卵母细胞减数分裂的进程
　　 [目的]
　　 确定Syt1对小鼠卵母细胞第一次减数分裂中后期转换及其第一极体释放的影响。
　　 [研究方法]
　　 卵子的收集和培养、免疫荧光及激光共聚焦显微镜检测与第一部分相同。染色体铺片
　　 室温下，卵母细胞在1％柠檬酸钠溶液中放置10分钟后，固定在甲醇和冰醋酸3:1新配置的溶液中，之后10mg/ml PI用于染色体染色。封片后置于共聚焦显微镜下观察。
　　 Morpholino和β5-tubulin-GFP mRNA、H2B-RFP mRNA联合注射
　　 Morpholino是经过修饰的人工合成反义寡核苷酸链小分子，Syt1-morpholino序列信息如下:5’-GACTGGCACTCACCATTTTTGGTTC-3';Control-morpholino序列信息如下:5’-CCTCTTACCTCAgTTACAATTT ATA-3'。用Sigma水稀释。通过注射5-10pl的2mM MO和同体积的β5-tubulin-GFP mRNA和H2B-RFP mRNA的混和物。然后卵母细胞在含2.5μM的Milrinone中孵育24小时。新鲜M2培养液中洗5遍，置于新鲜M16培养液培养约2-3小时移入至含有10nM Hoechst33342的M16培养液中放到活细胞工作站继续培养14-15小时左右，并实时动态观察其变化。注射过程中GV期卵子均置于2.5μMmilrinone-M2培养基中，30分钟内完成操作。
　　 卵母细胞的活细胞动态观察试验
　　 为了追踪纺缍体、染色体和卵母细胞减数分裂进程在降调了Syt1的卵母细胞内的动态变化，我们向卵母细胞中注射β5-tubulin-GFP mRNA、H2B-RFPmRNA和Syt1 MO混合物，每个卵母细胞大约注射10 pL。经注射的卵母细胞培养至GVBD后放置Perkin Elmer precisely Ultra VIEW VOX活细胞共聚焦成像系统，继续培养14-15小时左右。我们使用了窄带通滤波器和一个绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白30％的削减中性密度日色度过滤器。根据tubulin-GFP和H2B-RFP的荧光强度，曝光时间在300毫秒到800毫秒之间。用IP Lab(Scanalytics)或AQM6(Andor/Kinetic-imaging)的软件系统支持数字化的延时成像技术。
　　 [结果]
　　 降调Syt1导致小鼠卵母细胞第一次减数分裂前中期/中期阻滞、极体排出率降低
　　 GV期卵母细胞注射MO后在含有2.5mM的米力侬的M2培养液中抑制24小时，然后释放，转移到M16培养液中继续培养，10小时或者12小时后收集A(Ⅰ)或者MⅡ期卵子。10小时收集的卵母细胞中，激光共聚焦纤维镜观察发现Syt1 MO组的卵母细胞大多阻滞在第一次减数分裂前中期或者中期，然而在对照组中卵母细胞已进入第一次减数分裂后期。Syt1-MO注射组Pro-MⅠ/MⅠ阻滞率为(91.80％，n=49)，较对照MO注射组(31.48％，n=54)显著增加(x2=39.055，P=0.000)。另外，12小时收集的卵母细胞中，Syt1-MO注射组极体排除率(45.33％，n=154)与对照组相比差异有显著性(60.76％，n=161，x2＝7.515，P=0.007)。
　　 降调Syt1阻碍了染色体分离，并激活纺锤体检验点活性
　　 降调Syt1后影响了小鼠卵母细胞同源染色体的分离及其纺锤体的异常现象促使我们考虑，进一步证实Syt1-MO降调影响到小鼠卵母细胞阻滞在Pro-MⅠ/MⅠ期。我们进行了染色体铺片实验验证染色体是否成功分离。如前所述，卵母细胞经Syt1-MO和control-MO注射后继续培养10小时，固定铺片后激光共聚焦显微镜观察，结果表明，Syt1-MO注射组，染色体仍处于未分离状态(10/10)，相比较而言，对照组中大部分染色体已分离，表明染色体已进入后期完成阶段(9/10)。降调Syt1阻碍染色体的分离现象，使得我们考虑，降调后是否激活了纺锤体检验点(SAC)的活性而引起，Bub3是SAC的一个重要组成成分，所以我们荧光定位检验点蛋白Bub3的表达，结果表明，Syt1-MO组ProMⅠ/MⅠ阻滞卵母细胞检测到Bub3的特异性信号，而对照组并没有发现这种特异性信号。这些数据表明Syt1降调后纺锤体检验点活性被激活。
　　 降调Syt1干扰小鼠卵母细胞的第一次减数分裂中后期转换
　　 为了进一步深入研究降调Syt1后引起的卵母细胞成熟障碍，我们向卵母细胞内注射了β5-tubulin-GFP mRNA、H2B-RFP mRNA和Syt1-MO或control-MO的混合物，并应用了活细胞工作站延时拍摄系统去捕捉纺缍体和染色体的动态变化。其中β5-tubulin-GFP mRNA和H2B-RFP mRNA分别用于观察纺锤体和染色体。注射卵母细胞释放后在M16培养液内培养约4-5小时移至活细胞工作系统观察。
　　 结果显示，在对照组中可观察到纺锤体约GVBD后2小时开始形成，之后清晰标准的双极纺锤体慢慢迁移到卵母细胞皮质区，然后发生中后期时期的转换，约观察7小时第一极体释放。而且我们观察了约40个对照组卵母细胞，几乎所有细胞在不同的减数分裂时期均呈现出对应各时期的正常形态纺锤体和排列正常的染色体，大部分均能完成第一极体释放。然而，在Syt1-MO注射组卵母细胞出现各种形态异常的纺锤体，直至13小时染色体仍不能正确分离且阻滞在Pro-MⅠ/MⅠ时期，之后约14小时染色体和纺锤体均出现紊乱分散在胞内，且部分染色体脱离纺锤体，接着出现异常的纺锤体和染色体重新聚合又分离现象，直至最后仍无第一极体出现。我们观察了约30个Syt1-MO注射卵母细胞，几乎所有细胞均出现了类似上述现象，只有两个卵母细胞出现第一极体释放，另外在观察过程中，几个细胞死亡。
　　 [结论]
　　 Syt1参与调控卵母细胞的减数分裂中第一次分裂中后期转换和第一极体的释放。

目录

摘要

第一部分 文献综述

第一节 卵母细胞纺缍体组装概述

第二节 Syt1的结构功能及其在小鼠卵母细胞中的作用

第三节 卵母细胞减数分裂中后期转换机制研究概述

第四节 目的和意义

参考文献

第二部分 研究论文

第一节 引言

第二节 材料与方法

第三节 结果

第四节 讨论

第五节 结论

参考文献

中英文缩略词表

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

声明

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