海马胆碱能神经刺激肽及其前体蛋白对胰岛β细胞影响与利拉鲁肽作用相关性研究

摘要

研究背景和目的:
　　 目前，中国已成为世界第一糖尿病大国，2008年中华医学会糖尿病学分会(CDS)组织的糖尿病流行病学调查结果显示，在20岁以上的人群中，年龄标化的糖尿病患病率为9.7％，而糖尿病前期的比例高达15.5％。糖尿病前期是糖尿病高危人群，约60％糖尿病患者来自此人群。
　　 2型糖尿病的病理生理机制呈复杂及多方面性，2008年Banting奖获得者Defrozon教授总结近年研究进展，提出胰岛β细胞分泌缺陷、肌肉组织葡萄糖摄取减少、肝糖输出增加、脂毒性、肠促胰岛激素减少、α细胞分泌胰高血糖素增多、肾小管重吸收葡萄糖增加及中枢对葡萄糖摄取的抑制反应下降8种2型糖尿病发病相关的病理生理机制。这些因素导致机体对葡萄糖摄取及储存、处理能力下降。而早在糖耐量减低阶段，胰岛β细胞数量已有明显下降，在确诊2型糖尿病时，胰岛β细胞数量下降可达60％，功能丧失可达80％。因此针对胰岛β细胞增殖、凋亡及分泌功能的研究至关重要。
　　 大量研究业已证实，神经末梢释放的乙酰胆碱可激活胰岛β细胞膜3型毒蕈碱样胆碱能受体(type3 muscarinicacetylcholine receptors，M3R)，进而作用于磷酸肌醇—蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)途径引起胰岛素分泌的扩增。而应用佛泊酯(Phorbol12-myristate13-acetate，PMA)直接兴奋PKC后，反而引起β细胞钙离子外流，抑制胰岛素释放，抑制乙酰胆碱扩增胰岛素释放作用。在中枢海马组织，海马胆碱能神经刺激肽前体蛋白（Hippocampal Cholinergic Neurostimulating Peptideprecursorprotein，HCNP-pp）经类糜蛋白酶裂解为HCNP。HCNP是含有11个氨基酸残基的多肽，可通过激活胆碱乙酰基转移酶（Cholineacetyltransferase，ChAT）促进乙酰胆碱合成，进而活化胆碱能神经受体系统。然而，HCNP对胰岛β细胞是否具有提高ChAT活性、活化M3R，进而促胰岛素分泌，目前尚无文献报道。
　　 HCNP-pp广泛存在于组织细胞中，又称为磷脂酰乙醇胺结合蛋白（phosphatidyl-ehanolamine-bindingprotein,PEBP）及raf-1激酶抑制蛋白(Raf-1kinaseinhibitorprotein，RKIP)。它可抑制raf-1激酶磷酸化，进一步抑制丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)信号转导途径的活化，抑制细胞增殖。已有研究证实，MAPK在胰岛β细胞增殖、分化中起重要作用，HCNP-pp特异地存在胰岛β细胞，作为Raf-1特异性抑制剂，可抑制β细胞增殖。然而，糖尿病状态下胰岛HCNP-pp含量如何变化，是否与β细胞增殖能力下降相关，目前尚无文献报道。
　　 胰高血糖素样多肽-1(Glucagon-likepeptide-1，GLP-1)在“肠—胰岛轴”中起重要作用。它作用于β细胞上G蛋白偶联的特异性受体，不但通过环磷酸腺苷-蛋白激酶A途径起“肠促胰岛素”作用，还与乙酰胆碱协同作用活化胆碱能神经受体引起胰岛素分泌。此外，细胞培养及动物实验业已证实GLP-1可激活MAPK通路，促进β细胞增殖。利拉鲁肽作为人胰高血糖素样多肽-1类似物，在促进胰岛素分泌及促进β细胞增殖均有明显作用，可能成为治疗糖尿病前期理想药物。然而利拉鲁肽是否可阻抑糖尿病前期的进展，利拉鲁肽的上述作用是否与HCNP及其前体蛋白相关，目前尚无文献报道。
　　 综上所述，本课题以β细胞株INS-1细胞及糖尿病前期OLETF大鼠为研究对象，从以下两个方面进行相关研究:1，观察HCNP对INS-1细胞胰岛素分泌的影响;通过对ChAT、M3R基因水平检测，探讨HCNP对INS-1细胞作用的相关途径。2，观测利拉鲁肽干预的糖尿病前期OLETF大鼠胰岛β细胞增殖及胰岛素分泌的变化;进一步对不同状态的OLETF大鼠胰岛细胞HCNP-pp、HCNP及GLP-1R的蛋白、基因水平进行检测，同时检测ChAT及M3R基因表达，探究利拉鲁肽影响胰岛增殖、胰岛素释放的可能机制。
　　 第一部分HCNP对INS-1细胞胰岛素分泌的影响
　　 目的:
　　 探讨HCNP对INS-1细胞胰岛素分泌的影响及可能的作用途径
　　 方法:
　　 (1)HCNP合成及纯度检测:应用固相化学合成技术人工合成含11个氨基酸残基的多肽，序列为:H-Ala-Ala-Asp-Ile-Ser-Gln-Trp-Ala-Gly-Pro-Leu-OH.采用反向高效液相色谱及电喷雾质谱法对产物进行分离纯化。
　　 (2)INS-1细胞的培养及活性鉴定:以含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基及在37℃，5％CO2培养箱中培养细胞。倒置相差显微镜观察生长情况。
　　 (3)胰岛素释放实验:80％INS-1细胞融合成片时，应用0.1％胰酶及0.1％EDTA混合液消化、吹散。接种于6孔板中，每孔6×105个细胞。随机分为3组:对照组、HCNP组、HCNP+PMA组。对照组INS-1细胞给予RPMI1640液培养，HCNP组INS-1细胞给予人工合成HCNP50pg/ml与RPMI-1640液共培养，HCNP+PMA组INS-1细胞予人工合成HCNP50pg/ml与RPMI-1640液共培养并在行胰岛素释放实验前加10nMPMA培养18小时。将各组INS-1细胞置于5％CO2培养箱中培养5天后弃上清，含3.3mmol/L葡萄糖KRBH液预培养40min，提取上清液，测定胰岛素浓度。3.0mlKRBH液再次冲洗后依次加含5.6、16.7mmol/L葡萄糖及新斯的明20μmol/L、氯化胆碱100μmol/L的KRBH液培养40min收集上清液，放射免疫分析方法测定胰岛素含量。
　　 (4)qRT-PCR检测ChAT及M3R基因表达水平:80％INS-1细胞融合成片时，应用0.1％胰酶及0.1％EDTA混合液消化、吹散。接种于6孔板中，每孔6×105个细胞。随机分为对照组及HCNP组;INS-1细胞经Trizol液裂解，按说明书提取总RNA，-80℃保存。设计ChAT、M3R基因mRNA序列的特异性引物，应用实时荧光定量PCR方法检测ChAT及M3R基因表达水平。
　　 结果:
　　 (1)在葡萄糖浓度为3.3mmol/L、5.6mmol/L及16.7mmol/L细胞培养上清液胰岛素含量。3.3mmol/L时，对照组、HCNP组及HCNP+PMA组分别为8.36±0.97、8.27+0.79、7.94±0.97μIU/ml;5.6mmol/L时，对照组、HCNP组及HCNP+PMA组分别为8.48±0.92、10.09±1.41、8.36±1.05μIU/ml;16.7mmol/L时，对照组、HCNP组及HCNP+PMA分另为8.73±0.75、10.82±1.32、8.88±1.01μIU/ml。当葡萄糖浓度为3.3mmol/L时，HCNP组胰岛素含量较对照组及HCNP+PMA组无显著变化，差异无统计学意义(F=0.535，P=0.592);葡萄糖浓度达5.6mmol/L时，HCNP组胰岛素含量较对照组及HCNP+PMA组均增高，差异具有统计学意义(F=6.340，P=0.006);同样，给予16.7mmol/L葡萄糖刺激INS-1细胞时，HCNP组胰岛素含量较对照组及HCNP+PMA组均增高，差异具有统计学意义(F=10.836，P＜0.001)。
　　 (2)HCNP处理组ChAT(3.01±0.47×105拷贝)及M3R(1.06±0.18)两者mRNA含量显著升高，对照组两者含量分别为:1.01±0.30、0.72±0.15;两组相比，ChAT、M3R基因表达水平的差异均具有统计学意义，ChAT(t=-8.837，P＜0.001),M3R(t=-3.546,P=0.005)。
　　 结论:
　　 (1)在3.3mmol/L葡萄糖浓度时，HCNP对INS-1细胞的胰岛素释放无明显作用，而在5.6mmol/L及16.7mmol/L葡萄糖浓度下，HCNP可促进INS-1细胞胰岛素释放，佛波酯可抑制HCNP此作用，提示HCNP作用可能通过PKC途径促进胰岛素释放。
　　 (2)HCNP组ChAT、M3R基因表达水平均高于对照组，提示HCNP促进胰岛素释放作用与INS-1细胞增高的ChAT、M3R基因表达相关。
　　 第二部分利拉鲁肽干预的糖尿病前期OLETF大鼠胰岛细胞HCNP-pp、HCNP变化对胰岛β细胞功能、增殖的影响
　　 目的:
　　 观测不同剂量利拉鲁肽干预的糖尿病前期OLETF大鼠HCNP-pp及HCNP变化对口服葡萄糖耐量试验、早期胰岛素分泌指数及胰岛素阳性细胞密度的影响，探究GLP-1R与HCNP-pp、HCNP的相关性。
　　 方法:
　　 (1)OGTT试验、早期胰岛素分泌指数及胰岛素阳性细胞表达密度检测:雄性4周龄OLETF大鼠饲养8-10周后，禁食15小时，行口服葡萄糖耐量试验（葡萄糖2g/kg，胃管灌入）葡萄糖氧化酶法分别检测30、60、90、120分钟鼠尾静脉血糖，按国际惯用的大鼠糖尿病诊断参考标准:血糖峰值＞16.7mmol/L和糖负荷2小时血糖＞11.1mmol/L，符合其中之一为糖耐量减低(ImpairedGlucosetolerance，IGT)。将处于IGT阶段的OLETF大鼠随机分为3组，每组8只;分别给予100μg/kg（L-100组）、200tg/kg（L-200组）利拉鲁肽及生理盐水1.0mL/kg（PBO组），一日两次腹腔内注射。LETO组大鼠给予生理盐水1.0mL/kg腹腔内注射。在给药12周再次行OGTT试验，应用酶联免疫吸附方法检测早期胰岛素分泌指数（糖负荷后30min胰岛素增量与葡萄糖增量的比值）即ΔIns30/ΔGlu30=(Ins30-FINS)/(Glu30-FPG);取胰腺行免疫组织化学染色检测胰岛素阳性细胞表达密度（Insulin-positivecellsdensity,Ins-PCD）。
　　 (2)胰岛细胞HCNP-pp、ChAT、M3R及GLP-1RmRNA荧光定量分析:将胰岛细胞应用Trizol液裂解，按说明书提取总RNA，-80℃保存。qRT-PCR法测定胰岛HCNP-ppmRNA、ChATmRNA、M3RmRNA及GLP-1RmRNA表达水平（单位均以×105拷贝表示，下同）。
　　 (3)胰岛细胞HCNP-pp、GLP-1R蛋白表达分析:提取胰岛细胞总蛋白，用Bradford法测定蛋白含量。以每毫升样品中的毫克蛋白量(mg/ml)表示。Β-actin作为HCNP-pp的内参照，采用Western印迹方法，增强化学发光法显示蛋白条带，测定大鼠胰岛CT-HCNP-pp、NT-HCNP-pp及GLP-1R蛋白的相对含量。
　　 结果:
　　 (1)OGTT试验、ΔIns30/ΔGlu30及Ins-PCD:经12周利拉鲁肽干预，PBO组大鼠空腹血糖(8.39±1.14mmol/L)、糖负荷2小时血糖(11.45±1.23mmol/L)均显著高于L-100组(7.15±0.84，8.60±1.23)、L-200组(6.45±0.61，7.59±0.47)及LETO组(7.15±0.84，8.60±1.23)差异具有统计学意义;大鼠空腹血糖(F=22.925，P＜0.001)，糖负荷2小时血糖(F=40.805，P＜0.001)。而ΔIns30/ΔGlu30（3.85±0.19）较L-100组（8.90±0.37）、L-200组(9.55±0.25)及LETO组(11.99±0.31)明显降低，差异具有统计学意义(F=8.895，P＜0.001);同PBO组胰岛素阳性细胞表达密度(0.67±0.08，个/μm2)相比，L-100组(0.68±0.07)胰岛素阳性细胞表达密度无明显变化，差异无统计学意义，而L-200组(0.84±0.08，)、LETO组（0.90±0.08）胰岛素阳性细胞表达密度显著增多，差异具有统计学意义(F=15.968，P＜0.001)。
　　 (2)大鼠胰岛细胞HCNP-pp、GLP-1R、ChAT及M3R基因表达情况:与PBO组HCNP-ppmRNA(5.38±1.47)相比较，LETO组(3.07±0.80)、L-100组（3.58±0.79）及L-200组(3.32±0.65)相对表达水平下降;与PBO组ChATmRNA(0.85±0.21)、M3RmRNA(0.21±0.05)及GLP-1RmRNA(10.97±2.90)相比，LETO组(分别为:3.33±0.53,0.51±0.08,17.27±3.18)、L-100组(分别为:1.73±0.21,0.38±0.05,15.O2±3.36)及L-200组（分别为:1.78±0.46,0.44±0.09,17.43±4.24）三者相对表达水平均明显增高，差异具有统计学意义;HCNP-ppmRNA(F=8.563,P＜0.001),ChATmRNA(F=55.106,P＜0.001),M3RmRNA(F=27.201,P＜0.001),GLP-1RmRNA(F=6.012,P=0.003)。
　　 (3)大鼠胰岛细胞HCNP-pp、GLP-1R蛋白表达情况:与PBO组CT-HCNP-pp(0.78±0.04)、NT-HCNP-pp(0.75±0.04)蛋白相对含量及NT-HCNP-pp/CT-HCNP-pp比值(0.96±0.O2)相比较，L-200组（分别为:0.66±0.04,0.53±0.02,0.85±0.04）及LETO组（分别为:0.68±0.05,0.57±0.06,0.84±0.07）均明显减低，L-100组(分别为:0.73±0.02,0.69±0.01,0.95±0.02)NT-HCNP-pp/CT-HCNP-pp比值与对照组差异无统计学意义。与PBO组GLP-1R蛋白相对含量(0.64±0.04)相比，L-100组(0.76±0.03)、L-200组(0.80±0.03)及LETO组（0.81±0.07）均明显增高，差异有统计学意义，CT-HCNP-pp(F=12.973,P＜0.001),NT-HCNP-pp(F=18.250,P＜0.001),NT-HCNP-pp/CT-HCNP-pp比值(F=17.632,P＜0.001),GLP-1R(F=20.467,P＜0.001)。
　　 (4)大鼠胰岛细胞HCNP-pp与GLP-1R蛋白、基因表达相关性分析:不同组别大鼠胰岛细胞CT-HCNP-pp(0.711±0.061)、NT-HCNP-pp(0.640±0.094)及NT-HCNP-pp/CT-HCNP-pp(0.897±0.071)与GLP-1R(0.750±0.083)蛋白相对水平呈负相关;同样，HCNP-ppmRNA(3.872±1.353)与GLP-1RmRNA(15.106±4.252)表达水平呈负相关。CT-HCNP-pp:y=-0.886X+1.380(R=0.649,t=-4.429,P＜0.001);NT-HCNP-pp:y=-0.623X+1.148(R=0.701,t=-5.107,P＜0.001);NT-HCNP-pp/CT-HCNP-ppy=-0.685X+1.364(R=0.582,t=-3.717,P=0.001);HCNP-ppmRNA:y=-1.563X+2.11(R=0.498,t=-2.982,P＝0.006)。
　　 结论:
　　 (1)利拉鲁肽具有改善IGT阶段OLETF大鼠血糖、早期胰岛素分泌指数及胰岛β细胞数量，可阻抑糖尿病前期的进展。
　　 (2)安慰剂组OLETF大鼠12周后87.5％进展为2型糖尿病状态;胰岛细胞GLP-1R下降、HCNP-pp增多，HCNP减少。提示上述指标变化与2型糖尿病的发生、发展相关。
　　 (3)各组大鼠胰岛细胞HCNP-pp与GLP-1R表达水平均呈负相关，推测利拉鲁肽活化GLP-1R阻抑糖尿病前期进展与HCNP-pp表达下降相关。

目录

摘要

前言

第一部分 HCNP对INS-1细胞胰岛素分泌的影响及相关机制探究

1 实验材料

2 方法

3 统计学分析

4 结果

5 讨论

参考文献

第二部分 利拉鲁肽干预的糖尿病前期OLETF大鼠胰岛细胞HCNP-pp、HCNP变化对胰岛β细胞功能、增殖的影响

1 实验材料

2 方法

3 统计学分析

4 结果

5 讨论

参考文献

全文小结

缩写词简表

致谢

博士研究生期间发表论文情况

声明

统计学审稿证明