去甲二氢愈创木酸体外抗骨肉瘤作用的实验研究

摘要

骨肉瘤是恶性骨肿瘤中最常见的一种，发病年龄多在10-25岁，严重威胁儿童和青少年的健康。骨肉瘤对放射治疗不敏感，主要采取手术联合化疗的手段进行治疗，骨肉瘤的化疗疗效得到肯定始于20世纪70年代，1982年提出新辅助化疗的概念，使骨肉瘤的保肢手术取代了常规截肢术。目前临床治疗骨肉瘤的化疗药物仍以阿霉素、顺铂和大剂量的甲氨蝶羚为主，其他还有近年来应用的异环磷酰胺等。虽然化疗在骨肉瘤的治疗中具有举足轻重的作用，但骨肉瘤化疗的总体有效率仍徘徊在70％左右。制约其疗效的主要因素有两方面，一是高剂量强度所导致的严重的毒副作用，由于化疗药物个体差异较大，有效剂量与中毒剂量十分接近，因此相同剂量对于不同个体可能发生严重的粒细胞和（或）血小板下降。二是肿瘤细胞原发或继发耐药问题，也是化疗失败的主要原因。因此有人因骨肉瘤的原发耐药问题质疑新辅助化疗。有研究指出，多药耐药是骨肉瘤化疗失败的主要原因。多药耐药基因产物P糖蛋白的表达与化疗失败有显著的相关性，P糖蛋白高表达是多药耐药的主要机制，P糖蛋白可通过它的疏水位点与疏水性抗肿瘤药物结合，由ATP供能，逆浓度梯度将药物泵出细胞外，导致细胞内药物浓度降低而产生耐药。研究表明，P糖蛋白的高表达合并肿瘤体积较大和发病年龄偏低，提示肿瘤复发率高。目前使用的肿瘤化疗药物存在副作用大和肿瘤细胞易产生耐药性等缺陷，因而从天然化合物中寻找低毒、高效的抗癌药物对于成骨肉瘤的治疗有重要意义。因而开发新的高效低毒的抗骨肉瘤药物或新的化疗增效药，是目前骨肉瘤治疗中的重要课题。
　　 去甲二氢愈创木二酸(Nordihydroguaiareticacid，NDGA)是木质素类雌激素活性物质，其生物学雌激素效应相当于17β—雌二醇效力的1/104了，约占茶叶干重的7％-8％，以常青灌木Larreadivaricata中含量最为丰富。去甲二氢愈创木酸具有抗炎，增强机体免疫力等多种生物学效应，被广泛的用作医药和化妆品原料。NDGA来源于天然物质，近年被证实具有抗肿瘤作用，裸鼠实验证明其在有效剂量范围内毒性反应小，开发NDGA作为抗肿瘤药品具有重要的现实意义和广阔的应用前景。通过裸鼠药物毒性评价实验检测各组指标发现用药后体重均有增加，其增长幅度与对照组相似，无明显差异，裸鼠的外观、色泽、大便、活动等均正常，未见明显的毒副作用，无毒性效应。NDGA能阻止乳腺癌、肝癌、肺癌、大肠癌及胶质瘤等多种肿瘤的发生和抑制其细胞的增殖，但是对骨肉瘤作用的研究还未见报道。
　　 肿瘤发生是遗传因素、环境因素共同作用导致细胞内信号通路失调的过程。在肿瘤发生早期，环境中致癌物或非致癌物等引起细胞代谢反应失调，随后信号通路失调，最终引起遗传变异和自由生长，导致肿瘤发生。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Themammaliantargetofrapamycin，mTOR)是一种高度保守的的丝/苏氨酸蛋白激酶，属于磷酸肌醇3激酶相关激酶家族。mTOR信号通路整合来自细胞内外的各种信号，调节细胞的代谢、生长增殖及存活等生理活动。mTOR在细胞内通过与其它分子形成复合物而保持生物学活性，目前认为主要有两种复合物:(1)mTORC1，由mTOR、Raptor、mLST8/GL和PRAS40组成。mTORC1能够被雷帕霉素(rapamycin，Rap)抑制，接受生长因子、营养及能量、氧应激等刺激，通过磷酸化下游底物4E-BP1和p70-S6K来调节蛋白质翻译与合成。(2)mTORC2，由mTOR、mLST8/GL、rictor、mSin1、PRR5/Protor组成。mTORC2对雷帕霉素不敏感，通过磷酸化下游底物Akt来调节生长因子信号通路。由于遗传变异或者环境因素等原因，导致PI3-k/Akt通路失调，mTOR信号通路在肿瘤发生过程中过度活化，促进了细胞增殖、生长、分化和存活。目前mTOR信号通路在骨肉瘤发病过程中的作用尚缺乏足够的研究，能否针对mTOR信号通路开发新的抗骨肉瘤新药还待于研究。研究目的:1.探讨NDGA是否具有抗骨肉瘤作用;2.探讨NDGA抗骨肉瘤作用的mTOR机制。
　　 研究方法:采用U20s、MG63、Saos三种骨肉瘤细胞系，用MMT、克隆形成实验检测药物对肿瘤生长抑制的作用;CCK-8法、细胞划痕试验和transwell小室模型分别测定药物对肿瘤黏附力、迁移力和侵袭力影响，用流式细胞技术进行细胞周期分析、凋亡率的测定，用荧光染色评估肿瘤凋亡的形态学改变;用Westernblot法检测药物对肿瘤细胞mTOR通路蛋白、凋亡标志蛋白caspase3、细胞周期素蛋白cyclinD1等的影响。
　　 结果:
　　 1.NDGA对骨肉瘤细胞具有抑制增殖的作用MTT检测结果显示，10μmol/LNDGA对骨肉瘤的增殖没有抑制作用，但从20μmol/L开始NDGA对骨肉瘤细胞具有明显的生长抑制作用，且呈时间和剂量依赖性。相同作用时间条件下，20、50、100μmol/LNDGA作用组间的比较表明，NDGA对骨肉瘤细胞的生长抑制作用随浓度的增加而增强;相同作用浓度条件下，24、48和72h各组间相比表明，NDGA对骨肉瘤细胞的生长抑制作用随处理时间的延长而增强。
　　 2.NDGA抑制骨肉瘤细胞克隆形成
　　 与对照组比较，不同浓度(10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L)的NDGA对骨肉瘤细胞克隆形成均有抑制作用，细胞克隆形成率随NDGA浓度升高而下降，NDGA浓度高于20μmol/L时细胞生长缓慢，每个克隆包含的细胞数目少，且随生长时间增加未再出现新增殖细胞，实验结束时存活细胞数量少、活力低下，几乎处于静止期;对照组及不同浓度处理组克隆形成率分别为25.5％、17.5％、7.5％、0.75％;各组克隆形成率均有显著差异，P＜0.05。
　　 3.NDGA抑制骨肉瘤细胞黏附
　　 NDGA可以显著抑制骨肉瘤细胞在纤连蛋白(Fn)的黏附。(10、20、50、100、150μmol/l)的NDGA作用24h后，黏附率分别为98.8±1.9％，86.9±2.0％，65.7±0.7％，32.8±0.8％和5.6±0.5％，20μmol/l以上的NDGA处理组与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)。
　　 4.NDGA抑制骨肉瘤细胞迁移
　　 划痕实验显示:10、20、50、100μmol/l的NDGA作用48h后，可见NDGA能明显抑制骨肉瘤细胞的迁移，呈剂量依赖性;随着NDGA的浓度增大，骨肉瘤细胞向划痕区移动的距离越来越小，随着药物浓度增加迁移至划痕区的细胞逐渐减少，划痕增宽，高剂量组仅有少许细胞迁移至划痕区;20μmol/l的NDGA可以使骨肉瘤细胞迁移能力基本丧失，但NDGA浓度高于50μmol/l时细胞大量死亡。
　　 5.NDGA抑制骨肉瘤细胞侵袭
　　 不同浓度NDGA处理的处理48h后，骨肉瘤骨肉瘤细胞侵袭穿透Matrigel胶和Transwell小室微孔膜的能力明显下降，实验组穿膜细胞数目随着药物浓度增加明显减少，对照组、30、50、100μmol/l组的穿膜细胞数目分别是(234.3±9.2)，（82.0±3.0），(39.0±3.0)，（12.3±1.5），各处理组与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)。说明NDGA以剂量依赖的方式抑制骨肉瘤细胞的浸润侵袭能力。
　　 6.NDGA诱导骨肉瘤细胞周期阻滞
　　 不同浓度NDGA(20、50和100μmol/L)作用骨肉瘤细胞24h后，细胞周期发生明显改变。流式细胞仪检测结果表明，NDGA作用后，Mg63、U2os骨肉瘤细胞周期被阻滞于G0/G1期，且该效应在50μmol/L后趋于明显，在100μmol/L浓度时效应最大，处于S期细胞所占比例的明显下降，但在Saos-2细胞，NDGA使骨肉瘤细胞周期被阻滞于S期。
　　 7.NDGA诱导骨肉瘤细胞凋亡
　　 不同浓度NDGA(100、150和200μmol/L)作用骨肉瘤细胞24h后，骨肉瘤细胞发生凋亡改变。流式细胞仪检测结果表明，100μmol/LNDGA作用后，骨肉瘤细胞主要出现早期凋亡，但150μmol/L以上的NDGA引起骨肉瘤细胞晚期凋亡。
　　 8.NDGA下调mTOR信号通路蛋白的活性
　　 NDGA作用骨肉瘤细胞24h后，Westernblotting检测可见，NDGA浓度高于50μmol/L时mTOR信号通路下游底物磷酸化4E-BP1和S6水平与对照组相比明显下调，但在低浓度（20μmol/L以下）时mTOR信号通路蛋白没有明显降低，甚至轻微上调。而NDGA高于100μmol/L时可以抑制Akt的磷酸化，NDGA不但抑制mTORC1信号通路蛋白的表达，而且抑制mTORC2信号通路蛋白活化。
　　 结论:本研究发现了NDGA抑制骨肉瘤细胞增殖、克隆形成、黏附、迁移、侵袭，并诱导肿瘤细胞周期阻滞和凋亡，其抗骨肉瘤机制之一可能是通过抑制骨肉瘤mTORC1和mTORC2信号通路的活性，提示NDGA是一种很有发展前景的抗癌新药，同时进一步证明了mtor通路影响骨肉瘤的发生发展的理论，为NDGA的临床应用提供了实验依据。

目录

摘要

第一章 去甲二氢愈创木酸抑制骨肉瘤细胞增殖和克隆形成及其机制

1．1 引言

1．2 材料和方法

1．3 结果

1．4 讨论

第二章 去甲二氢愈创木酸抑制骨肉瘤细胞黏附、迁移和侵袭及其机制

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．3 结果

2．4 讨论

第三章 去甲二氢愈创木酸引起骨肉瘤细胞周期阻滞和诱导凋亡及其机制

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．3 结果

3．4 讨论

参考文献

综述

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