动脉灌注诱导的选择性脑低温治疗大面积脑梗死的实验研究

摘要

大面积脑梗死是一种高致死率和致残率的急性脑血管病，多由于大脑中动脉和颈内动脉闭塞引起整个脑叶，甚至跨脑叶分布的缺血、水肿和坏死，其中最常见的是大脑中动脉梗死。研究表明，恶性大脑中动脉梗死的死亡率可达80％。因此，如何有效控制大面积脑梗死的发展，保护缺血区的神经细胞以降低致死率和致残率是目前国内外研究的热点和难点。溶栓治疗是目前治疗脑梗死最有效的措施，但严格的时间窗(4.5h)限制了它在临床的广泛使用。有研究表明，去骨瓣减压术能明显降低大面积脑梗死的致死率，但对致残率的影响有限。在神经保护药物方面，全球对多达千种以上的药物进行了研究，迄今为止亦对多达百种的药物进行了临床试验，但尚无一种药物在临床被证明有效。因此，许多学者呼吁要重视神经保护的非药物治疗手段，尤其治疗性低温。
　　 “治疗性低温”的脑保护作用国内外已进行了大量的研究，是目前极少数在临床上被证明有效的脑保护治疗措施之一。全身低温是目前主流的“治疗性低温”实施方法，但低下的降温效率和严重的并发症限制了它的临床使用，并大大减弱了它的脑保护作用。为最大限度降低全身低温的弊病，近年来许多学者开始探索选择性脑低温。选择性脑低温(selectivebraincooling，SBC)是指选择性降低病变区域脑温而不降低全身体温的一种“治疗性低温”实施方法。因其对于中心体温的影响较小，避免了全身低温所引起的各种并发症并显著提高了降温效率，因此引起了广泛的关注。血管内低温液体灌注可以使相应梗死区快速、均匀降温，是目前效率最高的选择性脑降温方法。动物实验表明，经颈内动脉的冷盐水灌注（intracarotidcoldsalineinfusion，ICSI）对于脑梗死有显著治疗作用。一个初步的临床研究也证实ICSI是安全可行的。但ICSI脑保护作用的发挥与其参数设置（降温深度和维持时长）是什么样的关系？ICSI脑保护作用的来源是什么，它们在不同情况下脑保护作用发挥中各自所占的比例有多大？ICSI的最大缺陷是红细胞压积(hematocrit，Hct)降低和维持时间太短，如何克服这些缺陷？为了解决这些问题，我们进行了如下研究:
　　 为了选择一个合适的动物模型，我们在定量脑电图监护下，比较了新西兰兔和Sprague-Dawley(SD)大鼠大脑中动脉栓塞(middlecerebralarteryocclusion，MCAO)模型的变异度，并得出了梗死体积的变异系数，最终选择了大鼠作为本研究的实验动物。然后，我们在大鼠身上系统的研究了不同参数ICSI的安全性和可行性，比较了ICSI与其他临床常用低温方式的脑保护作用，初步观察了ICSI中低温和血管冲洗在脑保护作用发挥中的权重。最后，为了克服ICSI对于Hct的显著影响以及维持时间短的缺点，我们研究了“间断灌注”模式，这是一种不同于传统持续灌注的新模式，有助于一定程度克服ICSI的缺陷。
　　 第一章:局灶性脑缺血动物模型研究
　　 选择合适的实验动物是好的实验研究的基础。兔脑的质量占体重的百分比远远小于大鼠与人，比较适合ICSI的研究。兔子局灶性暂时性缺血模型目前很少见，本实验旨在观察兔暂时性MCAO模型的变异度是否在可接受的范围，并与相应大鼠模型进行比较。首先，我们使用定量脑电图(quantitativeelectroencephalograph，qEEG)全程监测兔的脑缺血过程，筛选对于脑损伤敏感的qEEG指标。结果发现，术后48h脑梗死体积与振幅整合脑电图（amplitude-integratedelectroencephalography,aEEG）带宽、上界、下界和绝对波段功率β(absolutebandpowerβ，ABP-β)的降幅呈正相关;脑水肿体积与aEEG带宽、上界和下界降幅呈正相关;24、48h的神经行为学评分与各指标的相关性均无统计学意义。术后48h的梗死体积与相关qEEG指标的回归分析发现，aEEG下界降幅(x)与梗死体积(y)的方程为y=-10.514+43.345x(F=16.602;P=0.001;R2=0.510)，具有较好的拟合优度。脑水肿体积(y)仅与aEEG带宽降幅(x)的回归方程有统计学意义，方程为y=-1.943+18.563x(F=9.191;P=0.010;R2=0.434)。接着，我们运用经典的手术法复制兔MCAO模型，观察aEEG下界降幅与梗死体积的关系，评估模型的变异度。结果发现，在18只动物中，aEEG变化呈现三种不同类型:完全下降、不完全下降，以及降而复升。2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride(TTC)染色发现，aEEG完全下降的动物(5/18)有较大梗死灶;不完全下降的动物(4/18)梗死灶较小;降而复升的动物(9/18)有的没有梗死灶，有的仅有小梗死灶。相对和绝对梗死体积的变异系数分别为75.0％和68.6％。说明兔暂时性MCAO模型具有较大变异度。随后，我们在aEEG全程监护下，用线栓法复制了SD大鼠MCAO模型，没有发现aEEG有类似兔的改变，相对和绝对梗死体积的变异系数分别为9.5％和10.7％。因此，我们仍然选择大鼠作为ICSI研究的实验动物。
　　 第二章:颈内动脉冷盐水灌注的使用参数研究
　　 低温的深度和维持时长是其发挥脑保护作用的关键因素。首先，我们在健康大鼠身上研究了ICSI诱导的深度(24-26℃)、中度(28-30℃)和轻度(32-34℃)脑低温维持1h，以及轻度脑低温维持2h的可行性与安全性。结果显示，轻度低温1h灌注前后Hct无明显差异，其他各组Hct均被显著降低;各低温组血糖灌注前后差异不明显，而灌注后低温组与控制组比较有显著统计学差异。大脑TTC染色显示各组均无缺血坏死;Hematoxylinandeosin(H-E)染色显示各低温组的脑细胞以及灌注侧颈内动脉内皮细胞均正常。深度和中度低温组有一定死亡率，而轻度低温1和2h组均无死亡率。说明ICSI诱导的大鼠轻度低温维持1h是安全可行的，维持2h也不会导致死亡。
　　 接着，我们比较了ICSI与冰帽和全身低温对于2-hMCAO大鼠的治疗效果。运用TTC染色观察大脑梗死体积，干湿重法测脑含水量，评估神经行为学缺损，酶联免疫吸附法检测血清中神经元特异性烯醇化酶(neuron-specificenolase，NSE)、S100β和基质金属蛋白酶9（matrixmetalloproteinase9，MMP9）的浓度。结果显示，冰帽能使梗死体积减小27.4％(P＜0.05)，而全身低温和ICSI能使梗死体积减小47.6％和61.6％(P＜0.01);ICSI组的梗死体积显著小于冰帽组(P＜0.01)。全身低温组和ICSI组的含水量低于模型组，有统计学意义(P＜0.05);冰帽组的含水量低于模型组，但并无统计学意义。三组中，仅ICSI组的神经行为学评分与模型组的差异有统计学意义(P＜0.05)。血清学方面，ICSI组血清中NSE和S100β浓度低于模型组，有统计学意义(P＜0.05);全身低温组和冰帽组中各指标与模型组比较均无统计学意义;各低温组的血清MMP9浓度与模型组比较均无差异。说明ICSI对于脑梗死急性期的治疗效果优于冰帽和全身低温，而全身低温比冰帽有更好的疗效。
　　 通过以上研究，我们得到了ICSI的安全使用范围，同时发现在此范围内ICSI的脑保护作用仍然强于目前常用的冰帽和全身低温。但ICSI发挥脑保护作用的最佳维持时长还不清楚，因此我们观察了不同低温维持时长对于2-hMCAO大鼠梗死体积的影响。结果发现，不同时长ICSI均能降低MCAO大鼠的梗死体积，但各组之间无统计学差异。说明ICSI中除了低温外，血管冲洗的脑保护作用不容忽视。
　　 ICSI的脑保护作用主要来源于低温和血管冲洗，为了观察二者在ICSI脑保护作用发挥中的权重，我们将ICSI的实施设定在2-hMCAO后的不同时间点(0、1、2h)，所观察的指标为脑梗死体积、脑含水量、行为学评分，以及血清学指标。结果发现，再灌开始后即刻实施灌注时，ICSI和颈动脉内等体温盐水灌注(intracarotidnormothermicsalineinfusion，INSI)对于脑梗死灶、行为学和血清S100β的影响无明显差异，不过ICSI尚能减小脑含水量和血清NSE水平。当再灌1h后开始实施时，ICSI和INSI均能减小梗死灶，但ICSI还能降低脑含水量、行为学评分和血清S100β水平，表明血液再灌后1h实施的INSI所诱导的血管冲洗仅贡献于减小脑梗死灶。血液再灌2h后，INSI与梗死组相比没有任何差异，而ICSI仍然被发现能显著减小梗死灶，缓解行为学损伤，并降低血清S100β水平，表明血液再灌2h后，血管冲洗的脑保护作用已经基本消失，而低温的脑保护作用仍然存在。以上结果表明，尽管ICSI中低温和血管冲洗的脑保护作用均会随着开始时间的延迟而逐渐衰减，但低温的脑保护作用能维持更长的时间。
　　 第三章:颈内动脉冷盐水间断灌注模式的初步探索
　　 ICSI具有很大的脑保护潜力，但是它很难被运用于临床，主要原因是由于持续液体灌注导致的Hct降低，以及有限的治疗时长。为了克服ICSI的这些缺陷，我们在前期工作的基础上将持续灌注的模式改为间断多次灌注，研究间断多次ICSI在干预大鼠3-hMCAO模型时的安全性和有效性，并与持续ICSI进行比较。结果发现，虽然持续灌注后的Hct仍在正常范围，但比灌注前明显降低(P＜0.05);间断灌注后的Hct虽然也有降低，但与灌注前相比无统计学差异;间断灌注显著延长了ICSI的维持时长，约为持续灌注的2.7倍;H-E染色和银染显示，间断ICSI对于梗死区神经细胞以及纤维均无明显不良影响;虽然间断和持续ICSI对于脑梗死体积和含水量的减小无统计学差异，但间断ICSI尚能降低血清NSE和MMP9水平。以上结果表明，ICSI的间断灌注模式是安全可行的，能有效缓解由于液体灌注导致的Hct降低，并延长了治疗时间，同时它对于大鼠脑梗死有潜在的更好的脑保护作用。
　　 基于动物实验研究，我们运用数学模型刻画了间断低温，发现初始温度固定，ICSI间断灌注模式的间隔时间只因治疗区间的不同而变化，治疗区间温度越低，间隔时长越短;对于相同的初始温度和治疗区间，由初温降到目标温度或由治疗区间的上界降至下界所使用的液体量是恒定的，与灌注速度无关;初始温度固定，由初温降到目标温度或由治疗区间的上界降至下界的时间与灌注速度呈负相关;灌注速度固定，由初温降到目标温度的时间与初始温度呈正相关;在初始温度为37℃，治疗区间为[34.5，35.5]，目标温度为34.5℃条件下，当注射量固定为7.5ml时，以12ml/h灌注可以维持最长的治疗时间(74min);而当治疗时间固定为70min时，9ml/h的灌注速度使用的液体量最小(7.5ml)。

目录

摘要

前言

第一章 局灶性脑缺血动物模型研究

第一节 筛选一种能客观评估兔脑梗死的定量脑电图指标

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．小结

5．参考文献

第二节 新西兰兔暂时性大脑中动脉栓塞模型的变异度分析

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．小结

5．参考文献

第三节 Sprague-Dawley大鼠暂时性大脑中动脉栓塞模型的变异度分析

1．材料与方法

2．结果与讨论

3．小结

结论

第二章 颈内动脉冷盐水灌注的使用参数研究

第一节 颈内动脉冷盐水灌注的可行性和安全性实验研究

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．小结

5．参考文献

第二节 不同低温诱导方式对于大鼠脑梗死急性期的治疗效果比较

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．小结

5．参考文献

第三节 ICSI维持不同时长对于MCAO大鼠急性期梗死体积的影响

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．小结

5．参考文献

第四节 ICSI中低温和血管冲洗神经保护作用的权重

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．小结

5．参考文献

结论

第三章 颈内动脉冷盐水间断灌注模式的初步探索

第一节 颈内动脉冷盐水间断灌注模式的实验研究

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．小结

5．参考文献

第二节 基于常微分方程的颈内动脉冷盐水灌注间断灌注模式的参数优化

1．“颈内动脉冷盐水灌注”常微分方程(ICSI-ODE)的选择

2．ICSI-ODE的拟合

3．ICSI-ODE的变量确定

4．ICSI-ODE的计算结果

5．讨论

6．小结

7．参考文献

结论

全文总结

综述

中英文缩略词表

主要仪器和试剂

致谢

博士研究生期间发表论文情况

声明

统计学审稿证明