四氢嘧啶类化合物Zl-5015的免疫抑制作用及其作用机制研究

摘要

目的:新型四氢嘧啶类化合物ZL-5015（1，3-二环戊基-1，2，3，6-四氢嘧啶-4，5-二甲酸二乙酯）兼具抗炎和免疫抑制活性，本研究采用体内和体外实验模型探讨ZL-5015的免疫抑制作用特点及作用机制，为后续的结构改造及深入的作用机制研究提供参考信息。
　　 研究内容:
　　 1.ZL-5015对正常小鼠免疫功能的影响
　　 1.1对体液免疫功能的影响---兔红细胞免疫小鼠产生血清溶血素(IgM)模型
　　 1.1.1材料与方法BALB/c小鼠50只，随机分为5组，各组动物均连续7天给药，给药后第2天上午，每只鼠腹腔注射20％(V/V)的兔红细胞生理盐水0.2 ml进行免疫，同日下午继续给药，免疫后第6天（免疫当天为第0天），动物摘眼球取血，分光光度法检测各组小鼠血清中的溶血素水平。
　　 1.1.2结果ZL-5015高、中剂量组(200、100 mg/kg.b.w)能明显抑制小鼠血清溶血素水平，抑制率分别为32.8％和20.0％(P=0.000，P=0.000)，ZL-5015低剂量组(50 mg/kg.b.w)能轻微抑制小鼠血清溶血素水平，但与溶媒对照组比较差异无统计学意义。
　　 1.2对细胞免疫功能的影响---二硝基氟苯(DNFB)诱导小鼠迟发型超敏反应(DTH)模型
　　 1.2.1材料与方法BALB/c小鼠50只，随机分为5组，给药第一天用1％DNFB致敏小鼠，连续给药7天，于致敏后第7天，取1％DNFB丙酮-橄榄油(1∶1)20μL均匀涂布于每只小鼠右耳的两面进行攻击。于攻击24 h后，给小鼠称重，颈椎脱臼处死，剪下左右耳廓，以左右耳片质量差值作为肿胀度，并计算肿胀率。取出脾脏和胸腺称重并计算相应的器官指数。
　　 1.2.2结果ZL-5015高、中、低剂量组(200、100、50 mg/kg.b.w)与模型组比较，均能显著抑制二硝基氟苯诱导的小鼠耳廓肿胀(P=0.000，P=0.000，P=0.015)，抑制率分别为:56.45％、47.58％、29.84％。ZL-5015高剂量(200 mg/kg.b.w)能抑制小鼠的脾脏指数(P=0.013)，中、低剂量组(100、50 mg/kg.b.w)无抑制作用(P=0.482，P=0.418)。ZL-5015高、中、低剂量组(200、100、50 mg/kg.b.w)对小鼠的胸腺指数无显著影响(P=0.384，P=0.527，P=0.570)。
　　 1.3 ZL-5015对网状内皮细胞（巨噬细胞）吞噬功能的影响（碳粒廓清实验）
　　 1.3.1材料与方法BALB/c小鼠50只，随机分为5组，连续给药7天。末次给药1h后，先称小鼠体重，每只小鼠尾静脉均注射印度墨汁（用生理盐水稀释6倍），按0.1ml/10g注射。分别于注射后于1 min(t1)和10 min(t10)小鼠眼球取血，检测OD450值，最后将小鼠颈椎脱臼处死，同时摘取小鼠肝脏、脾脏，并称湿重，计算廓清指数(K)及吞噬指数(A)。
　　 1.3.2结果化合物ZL-5015高、中、低剂量组(200、100、50 mg/kg.b.w)对小鼠吞噬指数A无明显影响(P=1.000，P=0.999，P=1.000)。
　　 2.ZL-5015对大鼠佐剂性关节炎模型的影响
　　 2.1 ZL-5015对大鼠佐剂性关节炎模型关节炎指数、足趾肿胀度、体重的影响
　　 2.1.1材料与方法雌性SD大鼠48只，随机分为6组，每只鼠左后足趾皮内注射100μL弗氏佐剂，致炎后第16天开始给药和测量，共给药12天。采用排水法测足部体积:在大鼠足部踝骨关节突出部位划一条线作为标记，用足趾肿胀仪测量，间隔4天测一次足趾肿胀情况及体重。SD大鼠免疫后，根据大鼠四肢关节炎症的红、肿及硬化程度，计算多发性关节炎指数。
　　 2.1.2结果致炎后第20天，ZL-5015高剂量(200mg/kg.b.w)处理组关节炎指数与模型组比较明显下降，下降率为20.0％(P=0.010)，说明此时高剂量药物开始起效。对足趾肿胀及体重无显著影响。
　　 致炎后第24天，ZL-5015高、中、低剂量(200、100、50mg/kg.b.w)使关节炎指数分别下降34.5％、25.0％、19.0％(P=0.000，P=0.001，P=0.010)。高剂量能使足趾肿胀度下降49.5％(P=0.048)，中、低剂量使足趾肿胀度分别下降40.4％及21.5％，但无统计学意义（P=0.194，P=0.845）。对体重有增重趋势，但差异无统计学意义。
　　 致炎后第28天，ZL-5015高、中、低剂量(200、100、50mg/kg.b.w)使关节炎指数分别下降43.0％、36.7％、26.6（P=0.000，P=0.000，P=0.001）。高、中剂量使足趾肿胀分别下降54.0％及48.7％（P=0.034，P=0.041），低剂量下降39.4％，但差异无统计学意义（P=0.150）。对体重有增重趋势，但差异无统计学意义。
　　 2.2 ZL-5015对弗氏佐剂关节炎大鼠血清促炎细胞因子的影响
　　 2.2.1材料与方法于佐剂关节炎造模第28天，股动脉取血，3000rpm离心10 min，取上清，ELISA方法检测IL-1β及TNF-α活性。
　　 2.2.2结果ZL-5015高、中剂量(200、100 mg/kg)与模型组比较，均可显著降低关节炎大鼠血清IL-1β的水平(P=0.006，P=0.049)，且有浓度依赖趋势，抑制率分别为:27.0％，19.1％; ZL-5015低剂量组(50 mg/kg)可以轻微降低大鼠血清IL-1β的水平(P=0.426)。ZL-5015高、中剂量组(200、100 mg/kg)均可以显著降低大鼠血清TNF-α的水平(P=0.000，P=0.005)，且有浓度依赖趋势，抑制率分别为:29.2％，21.6％;ZL-5015低剂量组(50 mg/kg)可以轻微降低大鼠血清TNF-α的水平，但差异无统计学意义(P=0.173)。
　　 2.3 ZL-5015对关节炎部位促炎细胞因子的影响
　　 2.3.1材料与方法于造模第28天，大鼠断头处死，在非致炎侧踝关节上方0.5 cm处摘取肿胀的足爪，剪碎，生理盐水浸泡过夜，离心取上清，ELISA方法检测IL-1β及TNF-α活性。
　　 2.3.2结果ZL-5015高、中剂量(200、100 mg/kg)与模型组比较，均可显著减少关节炎部位IL-1β的含量(P=0.000，P=0.019)，且有浓度依赖趋势，抑制率分别为:30.3％，19.3％;ZL-5015低剂量(50 mg/kg)可以轻微减少炎症部位IL-1β的含量，但差异无统计学意义(P=0.123)。ZL-5015高、中、低剂量组(200、100、50 mg/kg)均可显著减少炎症部位TNF-α的含量(P=0.000，P=0.004，P=0.039)，且有浓度依赖趋势，抑制率分别为:31.9％，22.0％和15.2％。
　　 3.ZL-5015对淋巴细胞功能的影响
　　 3.1 ZL-5015对ConA和LPS诱导小鼠脾细胞增殖反应的影响
　　 3.1.1材料与方法Balb/c小鼠两只，常规制备脾细胞悬液，ConA(4μg/ml)和LPS(10μg/ml)刺激小鼠脾细胞增殖作为体外免疫模型，检测给药48小时后各组细胞的代谢活力。
　　 3.1.2结果ZL-5015高、中、低剂量均可以显著抑制Con A诱导的小鼠脾细胞增殖反应，(P=0.000，P=0.000，P=0.000)，且有浓度依赖趋势，抑制率分别是:33.10％、21.0％和13.28％。ZL-5015高、中剂量组均可以显著抑制LPS诱导的小鼠脾细胞增殖反应(P=0.000，P=0.000)，且有浓度依赖趋势，抑制率分别是:25.90％、14.95％，ZL-5015低剂量组有轻微抑制LPS诱导的小鼠脾细胞增殖反应的趋势，但差异无统计学意义(P=0.087)。
　　 3.2 ZL-5015对混合淋巴细胞培养反应的影响
　　 3.2.1材料与方法将BALB/c小鼠和C57BL/6J小鼠的脾细胞分别制成悬液，按照1∶1混合制成细胞浓度为6×106个/mL的细胞悬液，按分组加入药物，用96孔培养板培养72 h后各组细胞的代谢活力。
　　 3.2.2结果ZL-5015高、中、低剂量组均可以显著抑制混合淋巴细胞的增殖反应(P=0.000，P=0.000，P=0.037)，且有浓度依赖趋势，抑制率分别是:37.2％、17.4％和5.0％。
　　 3.3 ZL-5015对ConA刺激小鼠脾细胞分泌白介素2和干扰素γ的影响
　　 3.3.1材料与方法Balb/c小鼠两只，常规制备脾细胞悬液，ConA(4μg/ml)刺激小鼠脾细胞活化，检测给药48小时后各组细胞中上清液白细胞介素2和干扰素γ的含量。
　　 3.3.2结果ZL-5015高、中、低剂量组(40、20、10μM)均可显著抑制ConA诱导的小鼠脾细胞分泌白介素2(P=0.000，P=0.000，P=0.007)，且有浓度依赖趋势，抑制率分别是:29.37％、20.31％和11.35％。ZL-5015高、中、低剂量组(40、20、10μM)均可以显著抑制ConA诱导的小鼠脾细胞分泌干扰素γ(P=0.000，P=0.002，P=0.030)，且有浓度依赖趋势，抑制率分别是:31.9％、23.6％和15.9％。
　　 3.4 ZL-5015对小鼠脾细胞细胞因子mRNA表达的抑制作用
　　 3.4.1材料与方法Balb/c小鼠两只，常规制备脾细胞悬液，ConA（4μg/ml）刺激小鼠脾细胞活化，使用荧光定量PCR检测给药48小时后各组细胞中白细胞介素2和干扰素γmRNA表达的变化。
　　 3.4.2结果ZL-5015(40、20、10μM)可抑制由ConA诱导的IL-2 mRNA的表达(P=0.010，P=0.024，P=0.048)。ZL-5015(40、20、10μM)可抑制由ConA诱导的INF-γ mRNA的表达(P=0.005，P=0.013，P=0.043)。
　　 3.5 ZL-5015对LPS刺激小鼠脾细胞分泌IgG1和IgG2a的影响
　　 3.5.1材料与方法Balb/c小鼠两只，常规制备脾细胞悬液，LPS(10μg/ml)刺激小鼠脾细胞活化，各组给药作用48小时后，收集培养上清液检测IgG1和IgG2a的含量。
　　 3.5.2结果ZL-5015高、中剂量组(40、20μM)均可以显著抑制LPS诱导的小鼠脾细胞分泌IgG1，(P=0.000，P=0.001)，且有浓度依赖趋势，抑制率分别是:27.8％、18.0％;ZL-5015低剂量组(10μM)可以轻微抑制LPS诱导的小鼠脾细胞分泌IgG1，但差异无统计学意义(P=0.105)。ZL-5015高、中、低剂量组(40、20、10μM)均可以显著抑制LPS诱导的小鼠脾细胞分泌IgG2a(P=0.000，P=0.000，P=0.011)，且有浓度依赖趋势，抑制率分别是:31.6％、22.7％和13.7％。
　　 3.6 ZL-5015对T细胞亚类的影响
　　 3.6.1材料与方法脾细胞制备、实验分组及给药均同3.5.1所述，48小时后收集细胞，用荧光标记的抗小鼠CD3、CD4、CD8抗体染色，流式细胞仪检测。
　　 统计方法:
　　 3.6.2结果ZL-5015主要降低ConA诱导的CD4弱表达和CD3弱表达T细胞亚群(CD4LwCD3Low)的比例。
　　 统计学处理:应用SPSS11.5统计软件进行统计分析。T细胞亚类占细胞总数的比例以百分数表示，先采用R×C表资料的卡方检验对各组细胞的百分率差异进行多组间的总体检验，然后采用四格表资料的卡方检验进行组间细胞百分率的两两比较。定量数据结果以均数±标准差表示，采用单向方差分析法分析，先进行方差齐性检验，若方差齐用LSD方法多重比较;若方差不齐，采用Welch F检验和Dunnett's T3法多重比较。显著性水准取α=0.05，以P＜0.05时，组间差异具有统计学意义。
　　 结论:
　　 1、ZL-5015可降低兔红细胞诱导小鼠产生血清溶血素的活性，降低二硝基氟苯诱导的小鼠耳廓的肿胀度，对小鼠碳粒廓清的速率无明显影响，提示对小鼠的体液免疫及细胞免疫功能有抑制作用，对非特异性免疫功能无影响。
　　 2、ZL-5015可以减轻弗氏佐剂关节炎模型的关节炎指数，足趾肿胀，提示对类风湿关节炎具有一定的临床应用前景。
　　 3、ZL-5015可以减少弗氏佐剂关节炎模型血清及炎症部位中的促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的含量，提示对佐剂性关节炎的治疗作用与抑制促炎细胞因子的产生与关。
　　 4、ZL-5015可抑制ConA和LPS诱导的小鼠脾细胞的增殖反应，提示对T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖反应有直接的抑制作用。
　　 5、ZL-5015可以显著抑制混合淋巴细胞的增殖反应（代谢活力），提示对特异抗原诱导的淋巴细胞增殖反应有直接的抑制作用。
　　 6、ZL-5015可以显著抑制ConA诱导的小鼠脾细胞分泌白介素2和干扰素γ，提示其免疫抑制作用与抑制细胞因子的产生与分泌有关。
　　 7、ZL-5015可抑制由Con A诱导的IL-2及INF-γ mRNA的表达，提示其抑制细胞因子产生的作用环节在mRNA表达水平。
　　 8、ZL-5015可以显著抑制LPS诱导的小鼠脾细胞分泌IgG1和IgG2a，提示其可直接作用于B淋巴细胞而抑制抗体的产生。
　　 9、ZL-5015可降低Con A诱导的CD4弱表达和CD3弱表达T细胞亚群(CD4LowCD3Low)的比例，提示其作用机制可能是抑制CD4+CD3+细胞的活化与增殖，从而抑制免疫反应。
　　 10、总之，ZL-5015对体液和细胞免疫反应均有抑制作用，对T和B淋巴细胞的增殖与分泌功能具有直接抑制作用，对自身免疫性疾病动物模型有效，但需要高剂量（100mg/kg以上），与现有临床药物相比其作用强度还不够理想，需要进一步结构改造。

目录

摘要

前言

第一章 ZL-5015对正常小鼠免疫功能的影响

第一节 对体液免疫功能的影响---ZL-5015对小鼠血清溶血素水平的影响

第二节 对细胞免疫功能的影响---ZL-5015对正常小鼠迟发型超敏反应(DTH)的影响

第三节 ZL-5015对网状内皮细胞(巨噬细胞)吞噬功能的影响(碳粒廓清实验)

第二章 ZL-5015对大鼠弗氏佐剂性关节炎模型的影响

第一节 ZL-5015对大鼠弗氏佐剂性关节炎模型肿胀度、体重的影响

第二节 ZL-5015对血清促炎细胞因子的影响

第三节 ZL-5015对关节炎部位促炎细胞因子的影响

第三章 ZL-5015对淋巴细胞功能的影响

第一节 ZL-5015对ConA和LPS诱导小鼠脾细胞增殖反应的影响

第二节 ZL-5015对混合淋巴细胞培养反应的影响

第三节 ZL-5015对ConA刺激小鼠脾细胞分泌白介素2和干扰素γ的影响

第四节 ZL-5015对小鼠脾细胞细胞因子mRNA表达的抑制作用

第五节 ZL-5015对LPS刺激小鼠脾细胞分泌IgG1和IgG2a的影响

第六节 ZL-5015对ConA刺激小鼠脾细胞T淋巴细胞亚类的影响

参考文献

附录

攻读学位期间成果

致谢

声明

统计学审稿证明