乌拉坦和氯胺酮麻醉条件下大鼠初级听皮层听觉神经元纯音反应特性的比较

摘要

大脑初级听皮层(primary auditory cortex，A1)是听觉信息处理的高级中枢，它接受自内侧膝状体(the medial geniculate body，MGB)神经元的特异性投射，对到达大脑皮层的听觉信息进行初步加工和处理，并表现出一定频率拓扑分布。这一拓扑结构起源于耳蜗对音频的部位分析特性，即耳蜗底部响应低频而顶部响应高频的拓扑特征，并在听觉特异性传导通路中高度保留。大鼠A1区的音频拓扑表现为尾端响应低频信号，头端响应高频信号。A1区听觉神经元的频率选择性是其接收的丘脑兴奋性投射及皮层内环路抑制性信号整合的结果。旁抑制的存在可能限制了兴奋性输入，侧向锐化(lateral sharpening)了神经元的频率调谐，使得神经元表现出精确的频率响应特征。
　　 麻醉是进行在体动物实验的常用手段。它可以使得实验动物处于相对稳定的状态便于执行各种操作，然而不可避免会对研究对象的功能状态和反应过程产生一定影响。临床影像学研究表明，麻醉剂能减弱血氧水平依赖的听觉皮层活动，并且呈现出一定的剂量依赖性。电生理实验也证实，麻醉改变了听觉神经元的反应状态。我们在前期实验中也发现，乌拉坦麻醉条件下，大鼠A1区单神经元对纯音声刺激的反应表现出相当大的差异，其声反应类型和声反应特征都表现出复杂性和多样性。这使得我们在理解和分析听皮层单神经元的基本活动特性过程中产生了很大困扰。因此，衡量和判断麻醉的影响及其机制是听觉系统研究中必须注意的问题。
　　 听觉实验中常用的麻醉剂有戊巴比妥钠、乌拉坦（氨基甲酸乙酯）及氯胺酮等。研究证实，戊巴比妥钠主要作用于大脑皮质和网状结构的γ-氨基丁酸A型(γ-aminobutyric acid typeA，GABAA)受体，产生超极化，显著降低了皮层神经元的兴奋性，使得部分听觉响应神经元的反应类型发生变化，如频率响应范围变小或偏移，表现出较一致的“V”型声音感受野及给声起始型(on-set)反应，影响实验结果的真实性，因此本实验未采用戊巴比妥钠作为研究听觉皮层的常规麻醉药。氯胺酮是一类常用的镇痛药，主要作用于天门冬氨酸(noncompetitive N-methyl-d-aspartate，NMDA)受体，对烟碱型胆碱能(nicotinic acetylcholine，nAch)受体和五羟色胺(5-hydroxyptamine，5-HT3)受体也有一定作用，阻断丘脑皮层束对痛觉的传导，同时兴奋边缘系统，产生分离性麻醉的效果，其特点为显著地镇痛作用、较浅的镇静作用和明显的肌紧张作用，多与甲苯噻嗪联合麻醉。氯胺酮对抑制性电流影响较小，听皮层脑片研究证实氯胺酮还可抑制非NMDA型谷氨酸受体介导的兴奋性电流。但氯胺酮在动物体内代谢速率过快，实验中必须定时给予补充剂量以维持麻醉，不利于在体细胞贴附式记录的长时间进行。乌拉坦麻醉效果相对较稳定，麻醉维持时间长，对动物的呼吸几乎无明显抑制，比较适合用作时程较长实验的基础麻醉剂。乌拉坦作用机制复杂，离体脑片实验研究显示乌拉坦呈剂量依赖性使GABAA受体和甘氨酸受体介导的抑制性电流增加而兴奋性电流降低，表明乌拉坦对神经元的兴奋性和抑制性输入均双向效应，必然影响到突触后神经元的信息整合与输出，但这一效应在视皮层脑片并未得到证实。下丘听觉神经元的细胞外记录显示戊巴比妥钠、氯胺酮和乌拉坦这三种麻醉剂对神经元的自发放水平、声反应延时及反应类型均表现出差异性影响。关于不同麻醉药对初级听皮层听觉神经元声反应特性的影响未见报道。
　　 本实验选取Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠作为实验对象，分别用乌拉坦(urethane)和氯胺酮-甲苯噻嗪组剂(ketamine-xylazine，K-X)作为基础麻醉剂，选取短纯音作为刺激条件，用在体细胞贴附式记录的方式记录大鼠初级听皮层单神经元对纯音刺激的反应特征，提取神经元的自发放水平(spontaneous rate)、声诱发动作电位潜伏期(response latency)、最小阈强度(minimum threshold，MT)、特征频率（characteristic frequency, CF）以及相应声强下的频率带宽(bandwidth，BW)，绘制该神经元的纯音感受野(tonal receptive field，TRF)、频率-强度调谐曲线（frequency-intensity tuning curve）及刺激后时间直方图(post-stimulus time histograms，PSTHs)，分析两种麻醉剂对A1区听神经元声反应特性的影响，分析比较两种麻醉剂对初级听皮层单个听觉神经元的声音编码机制的影响，从而为听觉电生理实验中动物麻醉条件的选择提供一定的依据。
　　 实验在A1区共记录到117个听觉响应神经元。乌拉坦麻醉组62个，氯胺酮-甲苯噻嗪组55个。选取给声开始前10ms作为计算自发放水平的时间窗，对两种麻醉条件下神经元自发放水平进行了比较。结果显示乌拉坦麻醉组听觉神经元自发放水平相对较低，与氯胺酮组有显著性差异。神经元的自发放水平在一定程度上反映该神经元自身的兴奋性，提示在乌拉坦麻醉条件下，A1区听觉神经元整体表现较低的兴奋性。
　　 采用不同频率和声强的纯音刺激，观察不同麻醉条件对A1单神经元简单声反应特征的影响。与细胞外多单位记录相似，麻醉条件下的大鼠A1区可记录到5种不同类型的TRF。大部分神经元的TRF表现为底端闭合上端开放的单峰，形如字母“V”或“U”，定义为V/U-shape型，该类型TRF是听觉神经元对纯音刺激的最常见响应，表现旁抑制性输入对频率感受范围的削尖;底端闭合上端开放的多峰形，定义为多峰型(Multi-peak type)，具有较宽的频率响应范围，表明神经元接受较少的侧抑制;上下两端均闭合的封闭型(Closed type)，这类神经元在高声强区接受较多的抑制性输入，表现出声强反应的非单调性;少量神经元在兴奋性反应区中出现反应抑制或无反应的区域，称之为非典型型（Atypical type）;此外还有一些神经元对实验声刺激有固定发放，但无明确的频率或声强选择性，定义为非调谐型(Untuned type)。乌拉坦与氯胺酮麻醉组均可记录到这5种类型的TRF，但两组中各类型神经元所占比例有所不同。其中U/V型TRF在两组均表现最高比例，氯胺酮麻醉组的V/U-shape、Closed及Untuned神经元的比例低于乌拉坦麻醉;Multi-peak和Atypical型的比例则高于乌拉坦麻醉组，不同类型神经元在两种麻醉条件下的分布差异存在统计学意义，提示不同麻醉剂影响了听皮层神经元对声音频率和强度的感受野，这种影响可能是麻醉剂对神经元兴奋性和抑制性输入的不同效应的整合结果。
　　 进一步观察两种麻醉条件下，A1区单神经元对纯音响应的频率特征和声强特征，结果显示:乌拉坦麻醉组的CF分布在6.5-48.5 kHz之间，平均为28.0±1.5 kHz;氯胺酮麻醉组CF分布在7.0-55.7 kHz之间，平均为28.1±1.6 kHz。两组所记录神经元的CF均基本覆盖了SD大鼠A1区的全频段，且两者之间CFs的分布无显著性差异，即麻醉不影响A1区听神经元的频率选择性，提示麻醉可能不改变外周听觉感受器（耳蜗）对声音频率信息的初步分析及听觉传导通路按照拓扑结构对声音频率信息的上传。另一方面，乌拉坦麻醉组神经元的平均MT为22.4±2.7 dB SPL，显著高于氯胺酮组（13.8±2.8 dB SPL），结合前述乌拉坦组具有较低的自发放水平，进一步表明:与氯胺酮相比，乌拉坦降低A1区听神经元兴奋性的作用更加强烈。
　　 听觉研究中常用库值（Q值，特征频率与阈上某一强度下对应的带宽的比值，即CF/BW）来定量描述听觉响应神经元频率调谐范围。不同听觉响应神经元在CF相同的情况下，Q值越大，频率响应范围越窄，对频率的分辨率越精确。比较两种不同麻醉条件对神经元Q值（本实验中仅指Q10和Q30）的影响。结果显示两种麻醉条件下听觉神经元对纯音响应的Q值无显著性差异。这一结果与前述两种麻醉剂对单神经元声音感受野的影响不同存在一定的矛盾，其原因可能为大多数听觉神经元对纯音刺激仍表现为单峰型的典型响应，其他类型神经元记录例数较少，对频率响应分辨率的影响无统计意义。
　　 单个神经元同时接受来自突触前神经元的兴奋性和抑制性输入，经过整合后放电。动作电位延时的变化在一定程度上反映了兴奋性和抑制性输入的动态变化，是衡量神经元声反应特性的另一重要指标。我们对两种麻醉条件下记录所得神经元的最小反应延时(minimum response latency，Lmin)进行比较，发现乌拉坦麻醉条件下神经元表现出较长的Lmin(urethane:19.7±2.3 ms vs.K-X:12.7±1.2 ms)。依照各神经元Lmin和峰电位时间(peak latency，Lpeak)不同，将A1区听神经元的发放模式分为四类:给声起始型(Onset)，Lmin＜30ms;延迟反应型(Long-latency)，Lmin≥30 ms且Lpeak＜80 ms;反跳型(Rebound)，该类神经元在给声阶段表现为持续抑制，继而出现持续抑制后的反跳现象，其Lmin≥30 ms而Lpeak≥80 ms;起始反跳复合型(Onset-Rebound)。乌拉坦麻醉组可记录到上述4种类型的发放模式，而氯胺酮组仅观察到Onset、Rebound及Onset-Rebound这3种类型的发放，未记录到表现出Long-latency的神经元。Onset类型在两种麻醉条件下均占较大比例，但乌拉坦麻醉组表现较低的Onset型和较高的Rebound和Onset-Rebound型发放。表明乌拉坦麻醉条件下，神经元可能接受了增强/提前的抑制性输入或减弱/延迟的兴奋性输入，整合后表现出动作电位发放的相对延迟。
　　 根据上述结果，本实验得出以下结论:不同麻醉剂对A1区听觉神经元的声反应特性存在不同影响，表现出神经元自发放水平、声音感受野、声诱发反应的阈值、潜伏期及发放模式的不同，但麻醉剂对神经元的频率选择性无明显影响，即不改变声音频率信息在听觉系统中的传递路径。乌拉坦麻醉组中A1区神经元具有较低的自发放水平、较高的MT，较长的潜伏期及较高比例的V/U-shape和Closed型声音感受野，提示其效应可能与神经元自身兴奋性降低或突触前抑制性输入增强有关。

目录

摘要

第一章 综述：初级听皮层在听觉传导通路中的作用

1．1 听觉皮层的分区及初级听皮层的解剖构筑

1．2 初级听皮层声音信息处理的神经解剖学基础

1．3 初级听皮层对声音信息的编码机制

1．4 麻醉条件对初级听皮层声音信息的处理存在影响

1．5 在体细胞贴附式记录的优势

参考文献

第二章 乌拉坦和氯胺酮麻醉条件下大鼠初级听皮层听觉神经元纯音反应特性的比较

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 主要仪器、设备

2．2．3 实验动物

2．2．4 手术准备

2．2．5 在体细胞贴附式记录

2．2．6 声音刺激与数据采集

2．2．7 数据分析和处理

2．3 结果

2．3．1 一般情况

2．3．2 听反应神经元的TRF类型

2．3．3 两种麻醉剂对神经元CF、MT的影响

2．3．4 两种麻醉剂对A1区听神经元Q值的影响

2．3．5 两种麻醉条件下听反应神经元的自发放比较

2．3．6 两种麻醉条件对神经元听反应时间特性的影响

2．4 讨论

参考文献

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