188Re标记U87-EGFRvⅢ细胞的适配子在胶质瘤动物模型中的作用

摘要

指数级富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligands byexponential enrichment，SELEX)是一种针对靶分了筛选得到高亲和力、特异性强的核酸配基的体外筛选技术，由美国的Gold和Ellington在1990年建立。以完整细胞为靶标的Cell-SELEX技术可以在靶细胞的分子组成未知的情况下筛选得到适配子(aptamer)。Cell-SELEX技术是在SELEX技术的基础上发展来的，大大提高了筛选的效率和靶标的范围。目前这种技术在肿瘤研究中的应用日益广泛，可用于肿瘤的诊断和治疗。应用Cell-SELEX技术可以筛选出特异结合肿瘤细胞的适配子，因此Cell-SELEX技术在基础研究、临床诊断和疾病治疗等方面具有广泛的应用。胶质瘤是颅内常见恶性肿瘤，由于肿瘤呈浸润性生长，传统治疗方法包括手术切除、放疗和化疗，其效果极为有限，神经胶质瘤在颅内各种肿瘤中最为多见。据报道胶质瘤发病率占所有脑肿瘤的70％，其中多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme，GBM)是最常见的脑肿瘤，其预后极差，5年存活率不到3％。胶质瘤很难根治，往往会复发。由于传统的外科手术切除、放射治疗和化疗等治疗方法，受到放化疗抗性、血脑屏障对药物不通透等多种因素的影响，疗效受到明显的限制，因此对胶质瘤的靶向治疗的研究具有重要意义。EGFRvⅢ是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)胞外区2-7个外显子(EGFR△2-7)缺失导致的突变体，与肿瘤的侵袭性和致瘤性有关。EGFRvⅢ在正常细胞中不表达，仅存在于恶性的肿瘤细胞，在正常组织中不表达，因而是一个很好的肿瘤治疗靶标，用Cell-SELEX技术筛选针对过表达U87-EGFRvⅢ细胞的适配子对胶质瘤靶向治疗研究有重要意义，而且使用的Cell-SELEX技术具有简便、快速、经济等特点。适配子具有分子小、快速的血浆清除率、高组织穿透力、免疫原性低、稳定性好等特点，文献报道适配子可有效地应用于靶向治疗、检测和诊断等。2005年第一个适配子的药物“Mucagen”已经被美国FDA批准上市，另外针对核仁蛋白的AS1411等适配子也在临床试验中，这些都表明适配子在疾病治疗中作用。随着SELEX技术的进展，它已经成为了生命科学研究和医药研究中越来越重要的研究工具，凶此应用Cell-SELEX技术对胶质瘤细胞的靶标筛选和研究对胶质瘤的临床诊断、治疗及肿瘤基础研究具有很大的应用价值和前景，通过筛选得到的特异性适配子也将成为基础研究和应用研究中有效的分子识别工具。本研究分为两个部分：
　　 ㈠通过应用Cell-SELEX技术针对靶细胞U87-EGFRvⅢ筛选适配子。在第4轮开始引入反筛细胞U87MG，应用消减SELEX技术筛选适配子。在筛选适配子过程中严格地按照一定的比例投入文库的量，在每一次投入的次文库都要经过尿素胶鉴定。在洗涤细胞时随着筛选轮数的不断增加，洗涤时间和洗涤次数也逐渐的增加，文库与细胞的孵育时间也逐渐的减少。我们利用PCR技术扩增双链dsDNA，通过链霉亲和素磁珠分离法分离单链ssDNA，得到带FITC的单链ssDNA作为下次筛选的文库。PCR过程中需要对反应体系和各种试剂的反应量进行梯度摸索，最后确定为条带单一、纯度高、分子量为76 bp的为目的条带，结果表明PCR扩增得到的双链dsDNA和磁珠分离法得到的单链ssDNA均为条带单一、纯度高的分子量为76 bp目的条带，如此循环共进行11轮筛选，然后进行克隆和测序。利用在线软件分析序列同源性，找到了四条同源性一致的序列作为筛选得到的适配子，分别命名为适配子U2、U8、U19和U31。其次，通过公司合成5'端标记的FITC适配子U2、U8、U19和U31并对其鉴定，FITC标记的原库GN作为检测的对照适配子。通过流式细胞检测仪检测结合寡核苷酸的随着筛选轮数增加的富集情况;经过蛋白酶K分别3 min和10min不同程度消化细胞后来观察适配子与靶细胞U87-EGFRvⅢ结合的强度变化。结果发现:随着筛选轮数的增加，结合的寡核苷酸有富集作用;流式细胞检测仪检测到适配子与靶细胞U87-EGFRvⅢ结合的峰位比空白对照和原库GN对照的峰往右偏移，表明有富集作用。由于蛋白酶K会破坏细胞膜表面，因此对细胞进行不同程度的蛋白酶K消化，蛋白酶K对细胞消化3 min和10 min的不同程度后，对适配子与靶细胞U87-EGFRvⅢ的结合强度有一定的影响，随着消化时间的增加，对结合强度的影响越大，即峰的位置往左偏移越大。最后通过Pull-down实验来鉴定适配子结合U87-EGFRvⅢ细胞的靶蛋白，用Western blot方法进行鉴定。结果表明:适配子U2和U8均可特异性结合靶细胞U87-EGFRvⅢ靶蛋白，而且对照原库GN没有结合作用;适配子U2和U8对反筛细胞U87MG蛋白也没有结合作用。在3'端标记生物素适配子U2结合实验中，对细胞裂解液进行Western blot结合鉴定，以EGFR抗体结合为对照，结果表明适配子U2能特异性的结合U87-EGFRvⅢ。
　　 ㈡在建立裸鼠动物荷瘤模型上进行了适配子的体内抑瘤实验和188Re标记适配子U2在裸鼠荷瘤动物模型上的抑瘤作用、靶向性及代谢性。首先，选用4～6周的雄性裸鼠随机分成4组，每组7只，分别为空白组、转染试剂in vivo jet-PEITM组、DNA原库GN组、适配子U2治疗组。通过皮下种植U87-EGFRvⅢ细胞悬浮液建立荷瘤裸鼠动物模型，将筛选得到的适配子U2与原库GN进行瘤内注射，用in vivo jet-PEITM转染寡核苷酸，初步观察筛选得到的适配子对胶质瘤生长的抑制作用。结果发现U2治疗组肿瘤增长速度缓慢，肿瘤大小无明显变化;空白组肿瘤生长迅速，从第1次给药到剥离时（2周后），肿瘤有坏死倾向，转染试剂in vivo jet-PEITM组与DNA原库GN组比较，肿瘤增长速度与体积大小基本无差异（体积V=(Π)/6 ab2，a为长，b为宽）。在肿瘤形成时（皮下种植U87-EGFRvⅢ细胞悬浮液2周后）对各组肿瘤体积大小进行统计学分析，组组间没有统计学差异(n=7，P＞0.05)。对给药结束1周后剥离出来的肿瘤重量和体积进行One-way ANOVA分析，U2治疗组与空白组及试剂invivo jet-PEITM组均有显著性差异（n=7，P=0.000），与原库GN组有统计学差异（n=7，P＜0.05），结果表明适配子U2对胶质瘤增长有一定抑制作用，而且与其它组比较都有显著性差异。对剥离肿瘤的体积大小统计学分析也得出同样的结果(n=7，P＜0.05)。用188Re标记适配子适配子U2和原库GN进行瘤内注射，每只200 pmol（约2μg），每只给药量的标记适配子U2、GN及游离188Re的188Re放射性活度均为0.075 mCi，标记率为72％。以游离188Re组、188Re标记的原库GN组和空白组作为对照组，肿瘤体积与重量进行组组间单因素方差(One-way ANOVA)分析表明188Re标记适配子在裸鼠荷瘤动物模型上同样具有抑制肿瘤生长的作用，188Re-U2组与188Re-GN组、游离188Re核素组、空白组均有统计学差异（n=9，P＜0.01）。适配子可能是通过影响肿瘤细胞表面EGFRvⅢ蛋白的表达从而抑制肿瘤的侵袭性生长，因为适配子U2是针对靶标U87-EGFRvⅢ细胞筛选的，对于适配子影响胶质瘤细胞生长机制有待进一步研究。实验结果表明适配子可携带188Re用于胶质瘤的治疗。瘤内注射188Re标记的适配子GN、U2和游离的188Re核素后，在3h内检测标记的适配予与游离的核素代谢性情况。SPECT显影结果表明，瘤内注射188Re标记的GN和游离核素188Re立即可在肿瘤部位检测到核素显像，0.5 h后瘤内的显像逐渐减弱，1h后瘤内检测不到核素显像，在裸鼠其他器官如肝、膀胱等地方可以检测到核素显像，3h后裸鼠其他器官核素显像也逐渐的减弱，最后只能在膀胱检测到核素显像，尾静脉注射188Re标记的适配子U2、原库GN和游离的188Re核素SPECT显像检测均发现类似的结果，这些结果提示188Re标记的适配子U2、原库GN和核素188Re代谢主要是通过泌尿系统排泄。靶向性研究主要是通过裸鼠尾静脉各注射一定量188Re标记的适配子U2、原库GN和游离的188Re核素，1h后进行SPECT显像检测。显像结果表明在裸鼠尾静脉注射的适配子U2经过血液循环最后在瘤内可以检测到188Re放射性核素显影，但是188Re标记的原库GN和游离的188Re核素均没有集中在瘤内，即SPECT显影在瘤内检测不到核素显像。离体器官SPECT检测也表明188Re标记的适配子U2在瘤内可以核素显像，188Re标记的原库GN和游离的188Re核素在瘤内均见不到核素显像，但是在其他器官可以微弱的检测到核素显像，尤以肝脏检测的最多。因为肝是血运丰富的器官，这可能是肝内核素显像比较明显的原因。上述结果可以初步表明适配子具有一定的靶向性，主要靶向于U87-EGFRvⅢ细胞悬浮液种植的胶质瘤。综上所述，我们利用链霉亲和素磁珠法分离ssDNA进行Cell-SELEX技术筛选得到针对U87-EGFRvⅢ细胞的适配子并进行了鉴定;在荷瘤裸鼠动物模型中检测到适配子有一定的抑瘤作用;188Re标记的适配子在体内显像检测具有一定的胶质瘤靶向性并具有抑瘤作用。这些结果为适配子可应用于胶质瘤靶向治疗提供实验依据，可对胶质瘤的靶向治疗研究及代谢安全性研究提供实验基础。

目录

摘要

前言

材料与方法

1实验材料

2 方法

结果

1 凝胶鉴定目的条带

2 在线序列同源性分析

3 流式细胞仪检测适配子结合情况

4 流式细胞仪检测筛选过程中随着筛选轮数的增加的文库富集情况

5 蛋白酶K消化实验

6 ELISA法检测适配子的结合率

7 Pull-down实验检测适配子结合标靶

8 生物素化适配子与裂解细胞蛋白的结合

9 动物模型建立

10 in vivo jet-PEITM转染适配子在裸鼠荷瘤动物模型的抑瘤作用

11 188Re标记的适配子给药结束后剥离的各组肿瘤组织

12 188Re标记的适配子对胶质瘤荷瘤鼠的抑瘤作用

13 SPECT显像检测188Re标记时层析纸条188Re分布

14 SPECT显像检测活体及离体188Re体内生物分布

15 SPECT显像检测裸鼠尾静脉给药后，离体器官188Re的生物分布

讨论

小结

参考文献

综述 Cell-SELEX技术在肿瘤研究中的应用

缩略词表

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致谢

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