体外胰岛细胞共培养及化学因子联合诱导NOD鼠iPSCs分化为胰岛素分泌细胞的实验研究

摘要

研究背景:1型糖尿病是一种体内胰岛素绝对缺乏所导致的以高血糖为特征的终身性疾病，其发病率正在以3-5％的速度逐年提高。目前1型糖尿病患者在全球大约有2000万，中国至少有100万。1型糖尿病患者需终身胰岛素治疗以维持生命，目前尚没有有效的手段根治1型糖尿病，不合理的胰岛素补充所导致的高血糖或低血糖现象严重，以致各种并发症接踵而至，患者寿命普遍缩短。
　　 为了有效控制血糖，防止糖尿病并发症的发生，提高糖尿病患者的生存质量，替代被患者自身免疫系统破坏的胰岛素分泌细胞，胰岛细胞移植蓬勃兴起。而胰岛细胞的移植仍面临着两大难题:一、供体来源不足，二、免疫抑制药物的长期使用。自体诱导多能干细胞(iPSCs)由于不存在伦理和免疫排斥限制，有望成为诱导胰岛素分泌细胞的种子细胞。但是iPSCs极低的诱导效率极大制约了其在临床糖尿病治疗中的应用，如何安全高效地将自体细胞转化为iPSCs并诱导分化为有功能的胰岛素分泌细胞成为制约这项技术发展的难点。
　　 非肥胖型糖尿病小鼠(NOD mouse)来源于ICR鼠，是Makion等于1980年通过近亲交配和选择繁殖的一组具有白内障倾向的自身免疫性糖尿病的动物模型，病状的特征为尿频、多饮、高血糖、尿酸强阳性、高胆固醇血症，是目前人类研究1型糖尿病的良好动物模型。本实验利用反转录病毒将3个干细胞基因Oct4、Sox2、Klf4导入NOD鼠尾成纤维细胞中，将其诱导为NOD-iPSCs，并对其干细胞标记的表达及全能性进行了分析鉴定。由于摒弃了原癌基因c-Myc，高了安全性。采用可拆分的半透膜相隔离设计——建立一个胰岛细胞和iPSCs的共培养体系，在化学因子诱导分化的基础上，让胰岛细胞更为精确地模仿胰腺生存的微环境，分泌可溶性因子作用于iPSCs。研究体外胰岛细胞共培养及化学因子联合诱导是否具有更高的效率，并为之后胰岛素分泌细胞的分离纯化、功能检测、移植实验提供便利，建立优化的技术平台。
　　 第一部分
　　 目的:
　　 1.利用三因子(Oct4、Sox2、Klf4)构建NOD小鼠诱导性多能干细胞系。
　　 2.对所获得的iPSCs进行鉴定及全能性分析，以期获得与胚胎干细胞类似的多能干细胞。
　　 方法:
　　 1.制备逆转录病毒:包含Oct4，Sox2和Klf4三个基因的逆转录病毒质粒pMXs-Oct3、pMXs-Sox2、pMXs-Klf4及参照质粒pMXs-EGFP购自Addgene公司，使用DH5α细菌进行扩增后将4个质粒分别转染至逆转录病毒包装细胞Plat-E，48h后收集病毒上清，过滤、浓缩后用于感染鼠尾成纤维细胞。
　　 2.分离与培养NOD鼠尾尖成纤维细胞(TTFs):无菌分离成年的NOD鼠尾真皮，37℃下5％ CO2孵育5d，在这期间成纤维细胞从尾组织中迁移出来，消化后接种至平皿培养。1-3代内的细胞用于iPSCs的诱导。
　　 3.逆转录病毒感染TTFs及生成iPSCs:将收集的病毒上清感染生长良好的TTFs，约1周时可首次看到iPS克隆，20d左右iPS克隆可长至足够大被挑取扩大培养。
　　 4.鉴定iPSCs的生物学特性:通过镜下观察、碱性磷酸酶染色、反转录PCR（RT-PCR）、免疫荧光实验及畸胎瘤形成实验等对iPSCs形态、多能性基因表达情况、干细胞表面标记及全能性等进行鉴定分析。
　　 结果:
　　 1.制备逆转录病毒:逆转录病毒质粒转染Plat-E细胞48h后，荧光显微镜下可见绿色荧光表达(pMXs-EGFP)，转染效率约在50-70％之间，细胞状态良好。
　　 2.分离与培养NOD-TTFs:TTFs原代培养在接种后3-4h贴壁，细胞呈长梭形、多边形或不规则形，中间1-2个圆形或卵圆形的核，原代TTFs杂细胞较多，随着传代次数的增多，其纯度增高，一般第二代后即可得到较纯的细胞。
　　 3.逆转录病毒感染TTFs及生成iPSCs:包含三个干细胞基因的逆转录病毒感染TTFs后大约一周左右可以在镜下首次看到iPS克隆，而后克隆继续增殖，12d左右形成肉眼可见的iPS集落，16-20d时克隆长至足够大，此时进行挑取、消化、接种至饲细胞上传代培养。
　　 4.鉴定NOD-iPSCs的生物学特性:从TTFs获得的iPSCs镜下观察呈典型的克隆状生长，圆形或椭圆形，与饲细胞分界清楚;RT-PCR、碱性磷酸酶染色及免疫荧光检测iPSCs高表达胚胎干细胞相关基因及蛋白;种植在免疫缺陷鼠体内能够形成向内中外三个胚层分化的畸胎瘤，表明iPSCs具有多潜能性。未感染逆转录病毒的TTFs不具有上述胚胎干细胞（embryonicstemcell，ESCs）相关的细胞特性。
　　 结论:
　　 1.通过转导三个重编程因子(Oct4、Sox2、Klf4)可以将NOD鼠尾尖成纤维细胞诱导为多能干细胞，即NOD-iPSCs。
　　 2.NOD-iPSCs具有类似胚胎干细胞的生物学特性，并能维持长期多次传代，表明初步建立了NOD-iPS细胞系。
　　 第二部分
　　 目的:
　　 1.体外将NOD-iPSCs诱导分化为胰岛素分泌细胞。
　　 2.采用大鼠胰岛细胞共培养及化学因子联合诱导方法，建立一种更为安全、高效的诱导体系。
　　 方法:
　　 1.获取共培养所需大鼠胰岛细胞:6只SD大鼠隔夜禁食，麻醉后开腹后沿大鼠胆总管内逆行注入预冷的0.5mg/ml胶原酶p溶液8～10ml，使胰腺膨胀，迅速摘取整个胰腺。用Ficoll非连续密度梯度离心法纯化大鼠胰岛细胞。将获得的大鼠胰岛细胞种植于培养皿中，1640培养基+10％澳洲胎牛血清+2％双抗培养。用双硫腙(Dithizone，DTZ)染色检测胰岛的纯度，吖啶橙(AcridineOrange，AO)-碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色检测胰岛的活率。
　　 2.诱导iPSCs分化为胰岛素分泌细胞:
　　 实验分组:实验组:NOD鼠iPSCs+化学因子培养基+大鼠胰岛细胞共培养对照组1:NOD鼠iPSCs+化学因子培养基对照组2:NOD鼠iPSCs+胰岛细胞共培养+FP培养基培养，不加任何诱导剂。
　　 对照组3:单独培养NOD鼠iPSCs，不加任何诱导剂化学因子诱导法:
　　 第一阶段:将iPSCs种植在Matrigel基质胶(1∶50)包被的培养皿中，Dfl2培养基（补充0.2％ BSA，0.5×N2和0.5×B27）培养4天，同时加入诱导因子100 ng/ml activinA和1μM wortmannin将其诱导成内胚层细胞。
　　 第二阶段:第4天更换培养基为F12/IMDM（1∶1，补充0.5％ BSA，0.5％ ITS和0.5×B27），并加入诱导因子2μM RA、20 ng/ml FGF7及50 ng/ml NOGGIN培养4天，将其诱导为胰岛内分泌细胞。
　　 第三阶段:第8天更换培养基为高糖DMEM(补充0.5％ BSA，1％ ITS和1×N2)，并加入50 ng/ml EGF培养5天，促进胰岛祖细胞/胰岛内分泌细胞扩增。
　　 第四阶段:第13天更换培养基为DF12，并加入1％ ITS、10ng/ml bFGF、10 mM nicotinamide、50 ng/ml Exendin-4和10 ng/ml BMP2培养7-9天，促进胰腺内分泌细胞成熟。
　　 共培养方法:将iPSCs与大鼠胰岛细胞以半透膜相隔离，使两种细胞互不接触，培养液可以相互交流，大鼠细胞分泌的可溶性因子可以自由通过半透膜。将iPSCs接种于12孔板底层，培养，孔板中置入transwell insert，在孔板上接种β细胞，insert直径选0.4μm，保证细胞不能通过但培养液及可溶性因子可以通过。每10天更换一次新取大鼠胰岛细胞。
　　 3.检测胰岛素分泌细胞相关指标:通过形态学观察、双硫腙染色、RT-PCR、免疫荧光染色以及葡萄糖刺激试验检测诱导生成的细胞是否具有胰岛素分泌细胞的相关功能。
　　 结果:
　　 1.形态学观察及DTZ染色:诱导培养后，实验组及对照组1细胞逐渐聚集生长，约14天左右开始出现大小不一的细胞团。第20天时每个实验组Transwell培养体系及对照组1各有20～30个细胞团，形态不规则。富含锌离子的细胞团经DTZ染色后呈棕红色，其余细胞不着色。对照组2及对照组3未出现细胞团，细胞不着色。
　　 2.RT-PCR检测PDX-1表达:实验组及对照组1诱导后的细胞从第8天开始表达PDX-1蛋白，并且从第8天至第20天表达逐渐增强。对照组2及对照组3未见PDX-1表达。
　　 3.葡萄糖刺激胰岛素释放试验:实验组及对照组1细胞诱导培养第4、8、12、16、20天时，高糖刺激后可检测到胰岛素分泌，说明诱导后的细胞对葡萄糖刺激有反应，实验组和对照组1细胞诱导第8天时有微量胰岛素分泌，且实验组高于对照组(P＜0.05);实验组和对照组1从第12天开始胰岛素分泌明显增加(第12天和第8天比，P＜0.05)，持续至第20天，第8天至第20天实验组胰岛素分泌量均大于对照组，组内第12天与第16、20天相比差异无统计学意义。对照组2，对照组3培养上清中未测到胰岛素分泌。证明实验组分泌胰岛素最多，对葡萄糖刺激反应最大，且实验组早于其他组别产生胰岛素分泌，差异有统计学意义。
　　 4.免疫荧光染色:实验组及对照组1诱导后第20天的细胞表达胰岛素（绿色荧光）、C肽（红色荧光）。对照组2、3细胞不表达上述各种蛋白。
　　 结论:
　　 1.NOD-iPSCs能够在体外诱导生成类似体内的胰岛素分泌细胞，对高糖刺激有反应，具有储存分泌胰岛素的功能。
　　 2.大鼠胰岛细胞能分泌某些可溶性因子通过共培养体系加速分化进程，提高分化效率。因此，化学因子联合共培养体系为一种更为高效的诱导iPSCs分化为胰岛素分泌细胞的方法。

目录

摘要

前言

第一部分 利用反转录病毒将3个干细胞基因Oct4、Sox2、Klf4导入NOD鼠尾尖成纤维细胞中，将其诱导为iPSCs并进行鉴定分析

材料与方法

实验结果

结论

第二部分 体外化学因子及共培养联合诱导小鼠iPSCs分化为胰岛素分泌细胞

材料与方法

实验结果

结论

讨论

参考文献

附录：英文缩略词表

硕士期间论文发表情况

致谢

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