大鼠骨髓间质干细胞体外诱导横向分化为胰岛素分泌细胞的实验研究

摘要

[目的] 探索体外定向诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞横向分化为胰岛素分泌细胞的可能性，并检测诱导后的细胞是否具备分泌胰岛素和胰高血糖素的功能。 [方法] 利用长骨打断法从健康成年大鼠长骨中冲洗出骨髓细胞，用含20﹪胎牛血清(FBS)的LG-DMEM培养基培养原代细胞以利于细胞生长，通过换液将悬浮生长的造血干细胞及其它不贴壁的杂细胞去除，原代细胞长满汇合80﹪所需时间为7-9天，然后细胞通过传代进行纯化和扩增。采用两期诱导方案对第三代(P3)或以后细胞进行诱导，第一期：用诱导液1(含20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子，10ng/mL表皮细胞生长因子及2﹪B27的DMDM/F12培养液)诱导BMSCs向巢蛋白(nestin)阳性的祖细胞分化；第二期：用诱导液2(含10 ng/mL β细胞调节素，10 ng/mL肝细胞牛长因子，10 ng/mL活化素A和10 mmoL/L尼克酰胺及2﹪B27的HG-DMEM培养液)将nestin阳性的祖细胞向胰岛素分泌细胞诱导分化。用双硫腙(DTZ)染色鉴定诱导后的细胞团是否含有胰岛素；免疫荧光法、免疫组织化学法(卵白链霉素-过氧化氢-DAB)检测诱导前后nestin，、胰岛素、胰高血糖素蛋白的表达；用含5.6 mmol/L葡萄糖(L)、16.7mmol/L葡萄糖(H)的PBS缓冲液l mL先后不同次序分别孵育1/2 h、1h，收集上清，采用放射免疫分析法检测各上清中的胰岛素含量。 [结果]通过传代纯化后的BMSCs(P6)经流式细胞仪检测表面标志CD45(-)、CD29(+)及CD90(+)，并且检测传代后的细胞纯度可达99.88﹪。 BMSCs经第一期诱导3d即可检测出nestin蛋白的表达，两期诱导后的细胞团用双硫腙染色呈阳性。免疫细胞化学显示经两期诱导后的细胞团表达胰岛素、胰高血糖素等激素。放免分析结果显示二期诱导后的细胞团可以分泌少量的胰岛素，糖反应性较弱。 [结论]健康成年大鼠骨髓间质干细胞体外培养具有很强的增殖能力，并且具有一定的可塑性。传代纯化后的BMSCs通过添加不同生长因子组合经体外诱导可分化为分泌胰岛素的细胞团，且该诱导方案具有可重复性。理论上将有可能解决糖尿病自体胰岛细胞移植介入疗法所面临的供者细胞严重不足、移植排斥反应等问题，为介入放射学技术靶向性输注胰岛素分泌细胞提供前期理论基础，从而为“个体化胰岛细胞”的构建提供一种可行的选择。

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文摘

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绪 言

文献综述 骨髓间质干细胞体外分化为胰岛细胞的研究进展

第一部分 大鼠骨髓间质干细胞的分离、培养和鉴定

1.实验材料

1.1动物

1.2试剂与仪器设备

2.实验方法

2.1成年大鼠的骨髓间充质干细胞分离与培养(全骨髓贴壁法)

2.2成年大鼠骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶染色

2.3成年大鼠骨髓间充质干细胞表面标志的鉴定

3.结果

3.1成年大鼠BMSCs培养、纯化及活细胞形态学观察

3.2成年大鼠的P6代BMSCs表面标志的测定

4.讨论

第二部分 大鼠骨髓间质干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的观察和鉴定

1.实验材料

1.1动物

1.2试剂与仪器设备

2.方法

2.1体外诱导大鼠BMSCs向胰岛素分泌细胞团分化(两期诱导法)

2.2双硫腙染色

2.3免疫细胞化学鉴定抗原的表达

2.4放射免疫分析法检测胰岛索水平

2.5统计学分析

3.实验结果

3.1 BMSCs诱导分化过程中的形态改变

3.2双硫腙染色结果

3.3免疫组织化学法

3.4放射免疫分析法检测胰岛素分泌水平

4.讨论

结 论及展 望

致 谢

参考文献

作者简介

附 录