肾移植供受者KIR基因、KIR配体相关基因的实际错配几率研究

摘要

肾脏移植组织配型技术近年来的不断进步，还有新型免疫抑制剂及生物制剂的不断开发并越来越规范应用于临床，使得肾移植术后超急性（加速）排斥反应基本得以避免，另外急性排斥反应的发生率及排斥强度得以降低。可是往往在相同组织配型和应用相同免疫抑制剂的条件下，仍然有一部分病人发生了急性排斥反应，急性排斥反应不仅可以引起移植肾早期失功，而且也是影响移植肾以及受者长期生存的最重要因素之一。这也使得减低肾移植术后急性排斥反应并且延长移植物有功能生存时间成为需要解决的重大课题。目前发现除了传统的组织配型外，可能还有其他的移植免疫通路发挥着重要作用。自然杀伤细胞(nature killer cell NK细胞)和部分效应T细胞表面免疫球蛋白样受体(killer cellimmunoglobulin(l)ike receptor，KIR)作为的HLA的配体与移植排斥反应的关系在近年来得到国内外学者的重视。KIR分子属于免疫球蛋白样超家族，表达于NK细胞和部分效应T细胞的表面。KIR基因座位编码在常染色体19q13.4，且呈共显性表达，目前发现共有16种KIR基因，包括14个功能基因和2个沉默基因。其编码蛋白KIR受体为跨膜糖蛋白，按其胞浆区的长短KIR可以分为L型和S型，L型传导抑制型信号，称抑制型KIR(inhibitory KIR);S型传导活化型信号，称活化型KIR(activatory KIR)。KIR受体可特异性识别结合HLA-I类抗原，从而传导并调节NK细胞和部分效应性T细胞杀伤靶细胞的作用，又根据KIR受体在胞外区免疫球蛋白样结构域的数目，KIR基因编码蛋白分为KIR2D和KIR3D，KIR2D包括KIR2DL1～L5，KIR2DS1～S5;KIR3D包括KIR3DL1～L3和KIR3DS1。如抑制型受体KIR3DL1有三个免疫球蛋白样结构域并且含有免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-basedinhibitory motif, ITIM);如活化型受体KIR3DS(1)，其跨膜区还含有能与特异性接头蛋白相结合的带有正电荷的残基，不含有ITIM序列。抑制型KIR受体传导抑制信号并产生控制NK细胞杀伤效应，活化型KIR受体则缺乏ITIM基序，导致活化信号通路形成后刺激NK细胞和效应T细胞杀伤靶细胞。一个NK细胞可以单独或同时表达多个KIR2D和KIR3D分子，也可以单独或同时表达多个活化型和抑制型受体。一般来讲，KIR2D分子的配体为HLA-C，而KIR3D分子的配体为HLA-A或HLA-B。与活化型KIR受体相比，抑制型KIR受体与HLA-I类抗原结合的亲和性会更强，当抑制型和活化型KIR受体识别和结合同(一)HLA-I类抗原分子时，将会以抑制作用为主。KIR与相应HLA-I结合后可能产生以下4种情况:①当抑制型KIR与HLA-I结合而无活化型KIR与HLA-I相互作用时，因抑制信号通路启动而不产生细胞溶解:②当活化型KIR与靶细胞表面的相应HLA-I结合同时无抑制型KIR与HLA-I的相互作用时，形成刺激信号通路，导致靶细胞溶解。③如果KIR与相应HLA-I结合后HLA-I-KIR抑制型及刺激型信号均被启动，当刺激型HLA-I-KIR的相互作用强于抑制型HLA-I-KIR的相互作用时，仍可致NK细胞活化，靶细胞溶解。④如果KIR与相应HLA-I结合后HLA-I-KIR抑制型及活化型信号均被启动，当抑制型HLA-I-KIR相互作用显著强于活化信号时，产生抑制信号通路;或者既无活化又无抑制信号，故而不发生NK细胞所致的靶细胞溶解，这见于NK细胞识别正常组织的情况。目前，我们在临床上常规的组织配型包括HLA-A、B、DR基因分型，群体反应性抗体(Panel Reactive Antibodies，PRA)测定，补体依赖微量淋巴细胞毒(Health-Complemem Dependent Cytotoxieity，CDC)实验等。近年来对HLA生物学和造血干细胞移植等基础研究发现，HLA-C-KIR，即HLA及其配体KIR在造血干细胞移植及实体肿瘤治疗中可以形成不同的（刺激或抑制）免疫传导信号并发生不同的（排斥或耐受）免疫调节通路。另外，骨髓移植中均已将KIR-ligand-HLA-Bw4I80相关基因（KIR配体HLA-Bw4I80相关基因）列为组织配型错配分析中的一个独立分析参数。不同种族不同个体各种KIR基因的频率是不相同的，所以不同个体的KIR基因组合型也有所不同。KIR基因呈共显性表达，个体间因KIR基因组合型不同，其体内的NK细胞和部分T细胞表面KIR受体类型会有所不同，所表现出的免疫传导刺激信号通路也会不同。肾脏移植本身是受者接受供者的异类抗原即移植肾的过程，必然在受者体内发生一系列针对移植物的免疫反应。在肾脏移植后早期发生的排斥反应中HLA-I-KIR是否参与免疫应答作用是我们将探讨的问题，随着对KIR的不断深入研究，KIR与其配体之间的复杂关系将会被进一步阐明，使得通过主动干预调节KIR与其配体间的相互作用进行免疫治疗成为可能，对改善移植患者的预后有着重要的意义。目前研究已知的与KIR相关的基因主要包括:KIR-L基因、KIR-S基因、KIR配体HLA-C基因及KIR配体HLA-Bw4I80相关基因这几类基因。
　　 本研究以进行肾移植手术的尿毒症患者和相应供者为研究对象。采用序列特异性引物聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction Sequence Specific Primer,PCR-SSP)法检测尿毒症患者KIR-L基因、KIR-S基因、KIR配体HLA-C基因及KIR配体HLA-Bw4I80相关基因并分析其多态性，与正常健康人进行比较，结合KIR与其配体之间识别方式，探讨尿毒症患者中两者的关系及意义。最后应用回顾性分析的方法，通过分析肾移植受者KIR配体HLA-Bw4I80相关基因与其相应的供者匹配情况，探讨其与肾移植急性排斥反应及急性排斥反应后逆转的相关性，作为移植结果预测因素为临床制定治疗方案提供参考。本文分为以下两章：
　　 第一章：肾移植供受者KIR基因、KIR配体相关基因的实际错配几率。
　　 目的：检测KIR-L基因、KIR-S基因、KIR配体HLA-C基因和KIR配体HLA-Bw4I80相关基因在肾移植供者与受者中的分布频率，并探讨肾移植供、受者间这几类基因的实际错配几率。
　　 方法：选取我院2007年1月～2012年6月完成肾移植手术的322例受者（尿毒症组）及其196例供者（正常组），抽取外周静脉血2ml，采用聚合酶链式反应序列特异引物分型技术(PCR-SSP)分析数据，直接计数法计算表现型频率（phenotype frequencies，PF）。基因频率（gene frequencies，GF）应用公式GF=1-(1-PF)1/2计算。同时计算322对供受者之间这几类基因的实际错配几率。两组基因表现型频率、基因型频率的比较采用x2检验。计量资料的比较采用两独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 结果：正常组与尿毒症组KIR-L基因KIR2DL1、2DL2、2DL3、2DL4、2DL5、3DL1、3DL2和3DL3的的表现型频率(％)分别为95.9/92.6、31.6/43.5、92.8/98.1、99/100、35.2/50.9、96.9/96.3、100/100、100/100。322对肾移植供、受者之间KIR-L基因错配几率为0％～15.70％，平均错配几率4.725％，其中KIR3DL2和3DL3的错配几率为0％，KIR2DL5的错配几率15.70％。正常组与尿毒症组KIR-S基因KIR2DS1、2DS2、2DS3、2DS4、2DS5和3DS1的表现型频率(％)为31.6/43.5、32.6/43.5、21.4/19.9、90.3/92.6、18.4/29.2、39.3/56.5。322对肾移植供、受者之间KIR-S基因错配几率为1.50％～17.20％，平均错配几率9.10％，其中KIR2DS3的错配几率为1.50％，KIR3DS1的错配几率17.20％。正常组与尿毒症组KIR配体HLA-C基因HLA-C01、C02、C03、C04、C05、C06、C07、C08、C12、C13、C14、C15、C16、C17和C18的表现型频率(％)为35.2/34.5、3.1/1.9、46.9/43.5、13.3/12.7、1.5/3.7、8.2/7.5、36.7/36.3、21.9/23.6、16.8/9.0、0/0、10.2/14.6、5.1/10.9、1.5/1.9、0/0、0/0。322对肾移植供、受者之间KIR配体HLA-C基因错配几率为0.00％～7.80％，平均错配几率1.95％，其中HLA-C13、C17、C18错配几率为0.00％，HLA-C12错配几率为7.80％。322对肾移植供、受者之间KIR配体HLA-Bw4I80相关基因实际错配几率为76.09％，其中供、受者之间有错配245例（占76.09％），无错配77例（占23.91％），错配组是无错配组的3.18倍。KIR配体HLA-Bw4I80相关基因错配几率与其他KIR相关基因错配几率比较均有明显统计学差异(P＜0.05)。
　　 结论：在所有与KIR相关的基因当中，KIR配体HILA-Bw4I80相关基因在肾移植供受者间的错配率最高，可能与KIR配体HLA-Bw4I80相关基因血清分型较多有关。
　　 第二章：KIR配体HLA-Bw4I80相关基因错配与移植后急性排斥反应(AR)发生率及(AR)逆转率的关联。
　　 目的：探讨肾移植供、受者对中KIR配体HLA-Bw4I80相关基因错配在肾移植受者术后发生急性排斥反应(acute rejection，AR)发生及其逆转中可能的作用。
　　 方法：对322对肾移植供、受者抽取外周静脉血，采用PCR-SSP法检测HLA-Bw4I80相关基因。按照KIR配体HLA-Bw4I80相关基因在供受者间是否错配分为错配组与无错配组，其中错配组有245例受者，无错配组有77例受者，分析探讨两组受者在肾移植术后的急性排斥反应(AR)发生率及急性排斥反应逆转率是否一致。急性排斥反应的诊断标准根据临床表现、实验室检查、移植肾多普勒超声检查、移植肾穿刺活检等综合判断。采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。错配组与非错配组之间AR发生率及逆转率的比较采用x2检验。计量资料的比较采用两独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 结果：322对肾移植供受者对中KIR配体HLA-Bw4I80相关基因发生错配的有245例受者，无错配的共有77例受者。322例受者中发生AR患者共有26例（均按照AR诊断标准中第1、2条诊断，未进行肾组织活检）。245例KIR配体HLA-Bw4I80相关基因错配组受者移植后AR发生率为8.16％（20例），77例无错配组受者移植后AR发生率为7.79％（6例），两组AR发生率比较无统计学意义(P＞0.05)。错配组20例AR受者中有17例MP冲击治疗后平均15.4d逆转，2例MP冲击无效后改为OKT3治疗逆转，1例治疗无效后切除移植肾。无错配组6例AR受者中有4例MP冲击后平均23d逆转，2例治疗无效后切除移植肾。错配组AR受者中有10％（2例）MP冲击无效经OKT3治疗后逆转，逆转率为95.00％;无错配组100％受者仅用MP冲击治疗，逆转率为66.67％，两组OKT3使用率及AR逆转率均有明显差异，但无统计学意义（P＞0.05）。
　　 结论：KIR配体HLA-Bw4I80相关基因错配在肾移植受者AR发生及AR逆转中的不同作用，提示应该采用新的供、受者间相容谱模式来研究KIR相关基因与肾移植的关系，并进行大样本研究来深入探讨NK细胞对异体供肾的杀伤作用最终使肾移植受者长远受益。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 肾移植供受者KIR基因、KIR配体相关基因的实际错配几率

1．1 材料与方法

1．2 结果

1．3 讨论

1．4 结论

参考文献

第二章 KIR配体HLA-Bw4相关基因错配与移植后急性排斥反应(AR)发生率及(AR)逆转率的关联

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 结论

参考文献

附录：缩略词对照表

读硕士学位期间成果

致谢

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