UVB诱导细胞损伤机制及红景天苷保护作用的初步研究

摘要

背景：
　　 近年皮肤癌，特别是鳞状细胞癌的发生率明显上升，并呈年轻化趋势，据报道90％的皮肤癌与紫外线照射损伤有关。过量的紫外线照射可导致皮肤灼伤、晒黑及免疫抑制，长期作用还可以引起皮肤光老化，并诱发皮肤癌。
　　 紫外线辐射按波长不同分为UVA(315～400nm)、UVB(280～315nm)和UVC(100～280nm)。太阳辐射通过大气层时所有的UVC和大约90％的UVB能被臭氧、水汽、氧和二氧化碳吸收，UVA则较少受到大气的影响，因此，到达地面的紫外线主要是UVA和少量UVB。但是UVB的生物学效应强度是UVA的1000～10000倍，是引起皮肤光老化的主要诱发因素。同时，地球上方的臭氧层对紫外线的吸收作用急剧下降的区域，为310nm～315nm的范围内，即UVB的波长范围。近年来由于地球上方臭氧空洞的形成及增大，致使大气层对UVB的吸收减弱，并进一步导致到达地球表面的UVB的量迅速增加，因此UVB对生物体损伤的机制及其防护的研究具有理论和实际意义。当UVB引起的损伤发生于原癌和或抑癌基因时，将可能导致表皮细胞异常增生，甚至发生癌变。但目前临床治疗皮肤癌的方法有限，寻找一种新的有效的防治皮肤癌的天然药物就成为当前亟待解决的课题之一。
　　 红景天具有提高机体免疫力、增强体质、改善人体造血机能、抗缺氧、抗衰老、抗肿瘤、抗疲劳、降血糖、抗病毒、抗辐射、预防高原反应等多种功能。有研究发现UV照射后，红景天能够增强皮肤角质化细胞的抗氧化能力，具有一定的修复和光保护作用。
　　 UVB诱导的皮肤肿瘤的发生是一个复杂的连续过程，包括一系列基因如原癌基因、抑癌基因的遗传改变，其中，UVB诱导的肿瘤抑制基因p53的突变被认为是一个早期步骤。p53基因在体内充当“基因卫士”的角色，可以依靠对其下游因子的激活或抑制来调节细胞的生长与凋亡，具有诱导细胞周期组滞、DNA修复和促进细胞凋亡的作用，从而避免受损的DNA堆积、维持基因组的稳定性，以及调节细胞的分化与衰老，在细胞周期中具有重要的调节作用。已有文献报道，14-3-3σ位于p53的下游，受p53表达的调节，并在细胞的突变、细胞周期阻滞中发挥了重要作用。各种损伤因子引起的DNA损伤可激活p53去磷酸化，并结合在14-3-3σ转录起始位点上游1.8kb处的启动子，随后激活和升高14-3-3σ的表达，从而阻止细胞进入分裂期，以便进行DNA修复。另外，14-3-3σ也可以反馈调节p53的表达，稳定并且提高p53的转录活性，因此，在p53和14-3-3σ可能存在一个正反馈调节环以维持其功能。在癌组织中，突变的p53导致14-3-3σ表达降低，因此14-3-3σ不能形成G2阻滞，使得突变发生和染色体结构异常。
　　 目的：
　　 目前为止，关于红景天抗辐射、抗肿瘤作用的研究相对来说还是很少，而且对人体皮肤肿瘤的作用尚未见报道。本文以人体表皮正常细胞即HaCaT细胞、14-3-3σ高表达的HaCaT细胞及低表达的HaCaT细胞和鳞状细胞癌细胞即A431细胞为研究对象，研究了HaCaT细胞和A431细胞在UVB照射后存活率的差异，及红景天苷对UVB诱导的人体表皮正常细胞即HaCaT细胞、14-3-3σ高表达的HaCaT细胞及其低表达的HaCaT细胞和鳞状细胞癌细胞即A431细胞的保护作用进行了初步探讨。
　　 方法：
　　 1、细胞培养
　　 HaCaT细胞和A431细胞分别用含10％小牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM高糖培养基培养;14-3-3σ高表达、低表达的HaCaT细胞分别用含10％小牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、100μg/mlG418的DMEM高糖培养基培养，培养条件为5％CO2、37℃，饱和湿度的培养箱中培养。
　　 2、紫外光光源上海顾村光电仪器厂生产，并经上海市计量局检测，其发射的紫外线波峰为305nm，当光源距样品垂直距离为40cm时的功率密度为16.5μW/cm2。
　　 3、HaCaT细胞和A431细胞在不同剂量UVB作用后的存活率取对数期生长的HaCaT细胞和A431细胞用0.25％胰蛋白酶消化后计数，HaCaT细胞调整细胞密度为8～10×104/ml，A431细胞调整细胞密度为4×104/ml左右，并分别接种于96孔板，并于接种后12～24h，弃去原培养液，用100μlPBS清洗两次，再加80μlPBS覆盖细胞后在距UVB光源40cm处用不同剂量(0、5、10、15、20、25J/m2)的UVB分别照射两种细胞，并继续培养20h，MTT法检测细胞的存活率。
　　 4、HaCaT细胞和A431细胞在加入不同剂量的红景天苷后的存活率取对数期生长的HaCaT细胞和A431细胞用0.25％胰蛋白酶消化后计数，HaCaT细胞调整细胞密度为8～10×104/ml，A431细胞调整细胞密度为4×104/ml左右，并分别接种于96孔板，并于接种后12～24h，弃去原培养基，用100μlPBS清洗两次，再分别加入含有0、10、20、40、60和80μg/ml红景天苷的培养基继续培养20h，MTT法检测细胞的存活率。
　　 5、25J/m2的UVB照射HaCaT细胞和A431细胞后再加入不同剂量的红景天苷后的存活率取对数期生长的HaCaT细胞和A431细胞用0.25％胰蛋白酶消化后计数，HaCaT细胞调整细胞密度为8～10×104/ml，A431细胞调整细胞密度为4×104/ml左右，并分别接种于96孔板，并于接种后12～24h，弃去原培养基，用100μlPBS清洗两次，再加80μlPBS覆盖细胞后在距UVB光源40cm处用25J/m2的UVB分别照射两种细胞，同时设阴性对照组，并于照射后分别加入含有0、10、20、40、60和80μg/ml红景天苷的培养基继续培养20h，两种细胞均以未受照组作为对照。MTT法检测细胞的存活率。
　　 6、流式细胞术检测细胞周期分布在UVB照射前及照后12h、18h、24h收集HaCaT细胞并计数使细胞数大于1×106个，1000rpm离心3 min后用预冷PBS洗涤细胞2次。加入预冷的70％乙醇，于4℃固定过夜。固定好的细胞1000rpm离心3min，1 ml预冷的PBS洗涤细胞2次，500μlPBS重悬细胞并分别加入PI和RNases A，37℃避光孵育30 min后流式细胞仪进行检测。
　　 7、Western blot检测细胞p53，14-3-3σ蛋白表达的变化在UVB照前、照后1h、2h、4h、8h、12h收集HaCaT细胞，用全蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，提取的细胞总蛋白定量后进行SDS-PAGE电泳（10％分离胶和4％浓缩胶），转膜、5％脱脂奶粉封闭、一抗室温孵育2h、TBST漂洗、二抗室温孵育2h、TBST漂洗后进行化学发光反应后进行显影、定影。
　　 8、用PT-PCR和Western blot法，分别从RNA水平和蛋白水平检测不同种类细胞14-3-3σ表达效果。
　　 9、30J/m2的UVB分别照射HaCaT细胞、14-3-3σ高表达的HaCaT细胞及其低表达的HaCaT细胞和A431细胞后再加入不同剂量的红景天苷后的存活率取对数期生长的HaCaT细胞、14-3-3σ高表达和低表达的HaCaT细胞及A431细胞用0.25％胰蛋白酶消化后计数，14-3-3σ高表达和正常的HaCaT细胞调整细胞密度为8～10×104/ml，14-3-3σ低表达的HaCaT细胞调整细胞密度为1.2～1.3×105个/ml，A431细胞调整细胞密度为4×104/ml左右，并分别接种于96孔板，并于接种后12～24h，弃去原培养基，用100μlPBS清洗两次，再加80μlPBS覆盖细胞后在距UVB光源40cm处用30J/m2的UVB分别照射两种细胞，同时设阴性对照组，并于照射后分别加入含有0、10、20、40、60和80μg/ml红景天苷的培养基继续培养20h，四种细胞均以未受照组作为对照。MTT法检测细胞的存活率。
　　 10、统计学分析实验结果以均数±标准差（(X)±S）表示，数据处理采用SPSS13.0软件，同种细胞各组间细胞存活率采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，多重比较采用SNK法(Student-Neuman-Keuls)分析，行双侧检验，检验水准为P＜0.05。
　　 结果：
　　 1、不同剂量的UVB照射HaCaT细胞和A431细胞后细胞的存活率均呈下降趋势。与对照组相比，HaCaT细胞的存活率的改变从UVB照射15J/m2时有显著差异(P＜0.05); A431细胞的存活率的改变从UVB照射5J/m2时有显著差异(P＜0.05)，说明UVB对细胞有杀伤作用。
　　 2、不同剂量的红景天苷孵育20h后HaCaT细胞的存活率呈先上升后下降的趋势，但无显著差异(P＞0.05);而A431细胞的存活率则呈逐渐下降的趋势，且从红景天苷的剂量为40μg/ml时差异显著(P＜0.05)，说明红景天苷对正常皮肤细胞可能有保护作用而对癌细胞有杀伤作用。
　　 3、25J/m2照射后，加入不同剂量的红景天苷使HaCaT细胞的存活率呈先上升后下降的趋势，且在红景天苷的剂量为10、60和80μg/ml时差异显著(P＜0.05);而A431细胞的存活率呈逐渐下降的趋势，且从红景天苷的剂量为40μg/ml时差异显著(P＜0.05)，说明红景天苷对正常皮肤细胞在低剂量时有保护作用、高剂量时有杀伤作用，而对癌细胞有杀伤作用。
　　 4、HaCaT细胞在接受30mJ/cm2的UVB照射后，在照后18h发生了较明显的G2/M期阻滞。
　　 5、UVB照射后，HaCaT细胞的p53蛋白，磷酸化的p53蛋白的表达量在照后1h出现升高，于照后12h，磷酸化的p53表达水平开始下降，但仍高于对照组;14-3-3σ蛋白在照后1h也逐渐升高，至12h仍未见下降。
　　 6、14-3-3σ蛋白过表达的细胞株和HaCat细胞株相比，14-3-3σ的表达明显升高，而稳定转染株和HaCaT细胞株相比，14-3-3σ的表达明显降低。
　　 7、不同种类的细胞在UVB照射后单独UVB处理组细胞的存活率明显低于未处理组，且差异显著(P＜0.05)，说明UVB对细胞有杀伤作用。但是14-3-3σ高表达、低表达和正常的HaCaT细胞在UVB照射后单独UVB处理组细胞的存活率存在明显差异，说明14-3-3σ蛋白在UVB辐射中发挥了作用。在UVB处理后，HaCaT14-3-3σ-/-和A431细胞随着红景天苷剂量的增加，细胞存活率呈下降趋势，且从红景天苷剂量为20μg/ml时与UVB处理组相比差异显著(P＜0.05)，说明红景天苷联合UVB对癌细胞有杀伤作用;而HaCaT14-3-3σ+/+和正常的HaCaT细胞随着红景天苷剂量的增加，细胞存活率呈先上升后下降的趋势，HaCaT14-3-3σ+/+细胞在红景天苷剂量为40μg/ml时与UVB处理组相比差异显著(P＜0.05)，而HaCaT细胞随红景天苷剂量的增加细胞存活率的增加无显著差异(P＞0.05)，说明红景天苷对HaCaT细胞可能有保护作用。
　　 结论：
　　 1、不同剂量的UVB照射HaCaT细胞和A431细胞后细胞的存活率均呈下降趋势，为后续实验照射剂量的选择提供了依据。UVB诱导后红景天苷对正常皮肤细胞在低剂量时有保护作用、高剂量时有杀伤作用而对癌细胞有杀伤作用。
　　 2、14-3-3σ蛋白表达量不同的细胞在UVB照射后细胞的存活率存在明显差异，说明14-3-3σ蛋白在UVB辐射损伤中发挥了作用。而且14-3-3σ蛋白不同表达的细胞在UVB照射后，红景天苷对其保护作用与14-3-3σ蛋白的表达量有关，说明UVB照射后红景天苷经由14-3-3σ蛋白发挥了作用。红景天苷联合UVB对癌细胞的杀伤作用和对正常皮肤细胞的可能保护作用，使之可能成为新的防辐射药物。
　　 3、30mJ/cm2的UVB照射HaCaT细胞，可以激活p53的表达，并可能通过进一步激活其下游的14-3-3σ蛋白进而发挥G2/M细胞周期阻滞，达到保护细胞基因组稳定的作用。

目录

摘要

前言

参考文献

第1章 UVB对HaCaT细胞和A431细胞损伤存活率的影响及红景天苷保护作用的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第2章 UVB照射对HaCaT细胞周期的影响及可能机制的探讨

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第3章 14-3-3σ在红景天苷保护表皮细胞UVB辐射损伤中的作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

全文小结

综述 14-3-3σ蛋白的研究进展

硕士在读期间发表的论文

中英缩略词表

致谢

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