RUNX2基因调控人牙囊细胞生物学特性的可能机制——microRNA相关调控网络

摘要

颅骨锁骨发育不良(cleidocranial dysplasia，CCD)的患者，因为RUNX2基因（RUNT-related transcription factor2，又称成骨细胞特异性转录因子CBFα1）突变，导致牙齿迟萌或始终不能萌出于口腔。microRNA(miRNA)是近年的研究热点，为转录后水平的基因表达调控分子。本课题组前期研究提示RUNX2基因缺陷可能影响相关功能细胞的分化。但这种对细胞增殖分化的影响是否与miRNA有关？转录因子和miRNA之间往往可以通过相互作用来更精细准确地调节基因的表达，那么作为转录因子的RUNX2与miRNA是否有相互调控作用？本研究通过分析RUNX2与miRNA的相互调控，探讨RUNX2基因影响牙囊细胞生物学特性的miRNA相关的可能机制，试图为牙齿萌出障碍的研究提供新思路。本文内容共分为三部分:
　　 一、颅骨锁骨发育不全患者RUNX2基因突变检测
　　 目的:研究颅骨锁骨发育不全1例患者的RUNX2基因突变。
　　 方法:收集颅骨锁骨发育不全病例1例。患者来自广东省口腔医院牙周科门诊，男性，21岁，主诉为部分乳牙脱落后恒牙未萌，咬合不适，咀嚼无力，影响进食。首先对具有相关临床症状的患者详细采集病史，明确单发或家族聚集倾向;利用X线检查全面了解患者及其父母的全身骨骼发育情况;详细进行口腔专科检查，对其进行全身健康状况检查。结果显示该患者具有比较典型的CCD特殊面容，眼距增宽，鼻梁塌陷，额部圆突，颌面部小，面中部发育不足，侧貌为凹面形。口腔内表现为乳牙滞留，多数恒牙及多生牙埋伏于颌骨中，伴有锁骨发育不全，囟门闭合迟缓，第一指骨末端关节间隙变窄等等。临床特征符合颅骨锁骨发育不全(CCD)的诊断。患者的姐姐及双亲无异常，作为对照组进行研究。收集患者静脉血，提取全血基因组DNA，根据本课题组前期研究结果利用7对引物PCR扩增RUNX2基因7个外显子，双向直接测序，BLAST同源序列分析，检测基因突变位点。体外分离培养患者来源的牙囊细胞及正常对照牙囊细胞，进行Trizol法RNA提取，反转录获得cDNA，对cDNA测序验证基因突变。采用实时定量PCR(qRT-PCR)检测RUNX2 mRNA表达水平的改变。
　　 结果:全血基因组测序结果发现，患者RUNX2基因第2外显子插入TG突变，导致下游多位点规则套峰，而正常对照组测序中未见这种改变。该突变导致第104位的谷氨酸GAG(W)移码突变为色氨酸TGG(W)，并在第144位提前产生TAG终止密码子，使RUNX2蛋白翻译中止，引起c端部分氨基酸丢失。牙囊细胞cDNA测序结果相同。该突变型为c.309_310insTG。实时定量PCR结果显示，基因突变后RUNX2 mRNA表达下调，但无统计学差异(P＞0.05)。
　　 结论:本研究在CCD患者全血基因组DNA及牙囊细胞cDNA中均检测到RUNX2基因的相同突变位点，而家系中健康成员未发现此突变，进一步验证了RUNX2基因是CCD患者的致病基因。经搜索SNP数据库，未发现此突变位点的报告，证明本研究所检测到的为RUNX2基因新的突变位点，补充了国内外CCD致病基因的突变位点数据库。
　　 二、牙囊细胞中差异表达miRNA的筛选及靶基因预测
　　 目的:筛选RUNX2突变牙囊细胞和正常人牙囊细胞差异表达的miRNA并预测其靶基因。
　　 方法:首先从患者的下颌埋伏多生牙中分离了牙囊组织，实验组为颅骨锁骨发育不良患者（RUNX2基因突变）埋伏恒牙的牙囊，恒牙上方没有滞留乳牙，无旋转、倒置等，牙囊完整。对照组为牙位、年龄、性别与实验组匹配的正常人埋伏恒牙牙囊。分离牙囊，磷酸盐缓冲液洗去血污，用眼科剪将组织剪成1-2mm3的小块，以低糖DMEM培养液用组织块贴壁法培养原代牙囊细胞(Human dental follicle cells，HDFCs)，3d后去除未贴壁组织，每3d换一次液，胰酶消化，1∶3传代，显微镜下观察细胞形态，细胞免疫组化染色检测结果波形蛋白表达阳性，角蛋白表达阴性。收集第3至第5代牙囊细胞备用。取第5代对数生长期的RUNX2突变牙囊细胞(RUNX2+/m HDFCs)和正常牙囊细胞和（RUNX2+/+HDFCs），吸干PBS后抽提Total RNA，经琼脂糖凝胶电泳条带分析鉴定RNA的质量，采用TaqMan(R)Array Human MicroRNA A+B芯片检测差异表达的miRNA，以Average Delta Ct值计算2-△△CT，相对定量分析R UNX2突变牙囊细胞和正常牙囊细胞样品相关miRNA转录本之间的表达差异。通过生物信息学方法使用miRNA靶标基因数据库miRGen预测差异表达的miRNA靶基因，通过DAVID功能注释进行靶基因功能富积分析。
　　 结果:RUNX2突变牙囊细胞较正常对照牙囊细胞，miRNA表达有显著差异。有69种miRNA发生2倍以上表达上调（Fold change上调≥2），54种miRNA发生2倍以上表达下调（Fold change下调≥2）。通过miRNA靶标预测工具分析发现，以上共123种miRNA中带有靶标基因的有41个，该41个miRNA的靶基因总和2718个，其中8个靶基因已有报道与牙齿萌出及成骨破骨分化相关。利用DAVID功能注释软件针对GO和KEGG Pathway分析2718个miRNA靶基因在何种功能及信号通路里富集。GO分析得到得到差异miRNA的靶标基因表达产物主要作用于细胞组分及功能、信号分子与受体结合功能等方面。而KEGGPathway分析结果显示功能可能集中于癌症相关信号通路、MAPK信号通路等方面，因仅有4.6％-2.2％的相关靶基因富集于以上通路，故不列入继续讨论范围。
　　 结论:成功筛选出RUNX2突变牙囊细胞及正常对照牙囊细胞的miRNA表达谱，预测到部分靶基因。证实了RUNX2突变可能对相关miRNA的表达有影响。
　　 三、miR-146a和miR-335在牙囊细胞的表达及miR-146a的功能分析
　　 目的:研究miR-146a和miR-335在RUNX2突变牙囊细胞和正常牙囊细胞中的表达差异，分析miR-146a的相关功能。
　　 方法:在上述差异表达的miRNA中，miR-146a和miR-335均有10倍以上的表达下调（miR-146a下调16.96倍，miR-335下调10.72倍），靶基因预测结果部分相似，且文献报道这两种miRNA和RUNX2的表达或成骨分化相关，故选择miR-146a和miR-335进行进一步的研究。本部分首先利用miRNA原位杂交验证miR-146a和miR-335在RUNX2+/m和RUNX2+/+牙囊细胞中的表达差异。将5'-DIG-标记的miR-146a和miR-335 miRCURY探针滴加于第3代的RUNX2+/m HDFCs和RUNX2+/+HDFCs的细胞爬片上，观察阳性信号。在显微镜下对细胞爬片拍照后，进行灰度值半定量分析。之后，采用miR-146a mimic和miR-146a inhibitor（5'-FAM标记）转染第5代RUNX2+/+HDFCs。正常RUNX2+/+HDFCs作为对照组。转染后24 h，收集牙囊细胞，提取RNA，进行实时定量PCR分析牙齿萌出及成骨破骨分化相关基因RUNX2, CSF-1，OPG的表达变化。
　　 结果:原位杂交结果显示miR-146a和miR-335在RUNX2+/m牙囊细胞中的表达水平均有下调，半定量分析结果有统计学差异(P＜0.05)。该实验结果与microarray筛选结果具有一致性。可由此推断miR-146a和miR-335的表达水平变化与RUNX2突变相关。实时定量PCR结果显示miR-146a过表达后，RUNX2，CSF-1，OPG等基因表达下调。其中RUNX2和CSF-1的相对表达量在三组间(miR-146a mimic组，对照组以及miR-146a inhibitor组)均有统计学差异(P＜0.05)，而OPG虽在miR-146a过表达时有下降趋势，在miR-146a inhibitor和对照组间有统计学差异(P＜0.05)，但在miR-146a mimic和对照组之间无统计学差异(P＞0.05)。
　　 结论:RUNX2突变影响了miR-146a和miR-335的表达，而过表达miR-146a又会下调RUNX2,CSF-1和OPG，RUNX2和相关miRNA之间可能存在相互调控网络。
　　 本研究表明，RUNX2突变影响了miRNA的表达，而RUNX2与miRNA之间的相互调控可能是RUNX2基因影响牙囊细胞生物学特性的关键机制。

目录

摘要

前言

第一章 文献回顾

1．1 颅骨锁骨发育不全综合征

1．2 RUNX2基因

1．3 microRNA

1．4 牙囊及牙齿萌出的相关研究

第二章 颅骨锁骨发育不全患者RUNX2基因突变检测

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第三章 牙囊细胞中差异表达miRNA的筛选及靶基因预测

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第四章 miR-146a和miR-335在牙囊细胞的表达及miR-146a的功能分析

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

全文总结

参考文献

个人简历

攻读硕士学位期间成果

附录

致谢

声明