以gp120为靶点的HIV进入抑制剂的合成及筛选研究

摘要

研究背景和目的:
　　 艾滋病(Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)感染引起的疾病，严重威胁人类的生存，对人口健康和社会经济的发展产生巨大的影响，全世界估计有3400万人感染艾滋病。艾滋病病毒的基因组比已知任何一种病毒基因都复杂，而且变化多样。到目前为止，依然没有一种疫苗可以付诸大规模使用。在今后相当长的一段时期内，发展安全有效的抗艾滋病药物，依然是当前艾滋病预防和治疗的重点。
　　 迄今为止已有24种化合物实体和至少9种组合物被批准用于临床。可分为逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂和病毒进入抑制剂四大类。前两类药物易诱导HIV耐药性突变，而且对人体有较大的毒副作用，后两类仅有3种化合物实体被批准。
　　 HIV进入抑制剂，尽管目前仅有Enfuvitide(T-20)和Maraviroc两种，但它们对耐受前两类抗HIV药物的病毒依然有效。并且，进入抑制剂是作用在HIV感染的早期阶段，能够阻止HIV与靶细胞的融合，被认为在艾滋病的防治上具有更好的应用前景。开发新的阻止病毒进入的抗HIV药物也成为目前抗艾滋病药物研究的热点。
　　 HIV进入靶细胞的过程主要由包膜蛋白(Envelope Proteins，Env)介导。在HIV进入靶细胞过程中，首先是gp120与靶细胞上的CD4分子和辅助受体（趋化因子受体CCR5或CXCR4等）先后结合，随后跨膜亚基gp41的构型发生改变，介导病毒包膜与靶细胞膜的融合，完成病毒进入宿主细胞的感染过程。从病毒融合机制的角度，HIV进入抑制剂可分为三大类，一是干扰gp120与CD4受体结合;二是拮抗辅助受体，阻止其与gp120-CD4复合物结合;第三类是阻止gp41核心结构的形成，称为HIV融合抑制剂。目前，针对HIV进入抑制剂的研究主要集中在两个方面:一是针对gp120为作用靶点，因为HIV gp120与靶细胞上的CD4受体相结合是病毒进入靶细胞的第一步，如果能在病毒感染的第一步就进行抑制，理论上则可对人体的危害性降到最低，有更好的应用前景;二是针对gp41六螺旋束核心骨架的形成进行抑制。
　　 作用于HIV gp120的进入抑制剂主要为大分子的抑制剂和小分子的抑制剂两大类。其中，大分子抑制剂主要为可溶性CD4及其衍生物以及靶向gp120的广谱中和抗体两大类;小分子的抑制剂主要以抑制gp120与CD4结合为靶点，或者以Phe43结合空腔为靶点。其化学结构主要为BMS-378806、BMS-488043和NBD-556、NBD-557及其类似物。
　　 Zhou T等人从HIV感染者的血清中分离出两个抗体，VRC01和VRC02，它们能够抑制200多各种亚型HIV毒株中的90％，这是迄今为止分离得到的最广谱、最有效的中和抗体。通过VRC01-gp120共结晶的单晶X-射线衍射结构分析，VRC01的结构与CD4有一定的相似性，能部分地模拟CD4与gp120的结合。与CD4不同的是，VRC01在CD4与gp120结合方向上偏转了43°，并且离开了6(A)的距离。这使得VRC01既能结合于gp120上易受攻击的CD4作用位点，又能克服gp120表面糖基及构象的掩盖作用。VRC01上CDR H2的Arg61能插入到gp120上V5与β24围成的空腔中，并形成5个氢键的作用。Arg61结合靶穴可能是中和抗体具有广谱、高效活性的重要作用靶点。如果化合物能结合在这一结合靶点，则可能具有较好地抗HIV感染的活性。这项研究为抑制HIV的感染找到了座标，使得研制艾滋病疫苗的目标更加明确;同时，也为设计作用于gp120的小分子化合物找到了新的作用靶点，目前还未见报道作用于此靶点的小分子化合物。
　　 小分子进入抑制剂研究方面:BMS-378806与BMS-488043结合在gp120上的CD4结合位点，从而阻止gp120与CD4的结合，其IC50为5 nmol/L。BMS-378806进入了Ⅰ期临床试验研究，但因其抗病毒谱太窄被中止了进一步的临床研究。BMS-488043进入了Ⅱ期临床研究，但因为剂量相对太大(1800 mg)而被暂停。针对BMS-378806所做的类似物的结构改造工作并没有取得很大的突破，目前还没有药物上市。NBD-556、NBD-557是本课题组大规模筛选33000个化合物的基础上得到的两个小分子化合物，化学结构为N-苯基-N'-哌啶基草酰胺衍生物。作用机制研究表明，NBD-556能抑制gp120与CD4的结合，并且是特异性地作用于gp120，而不是受体CD4分子。NBD-556能起到类似可溶性CD4的作用，结合到gp120上的CD4 Phe43结合口袋位置，诱导gp120发生构象变化，使gp120形成辅助受体结合位点。NBD-556活性在μM级，如何进行结构改造，提高其抗HIV活性，以及对各种亚型HIV病毒株的广谱抑制活性，是这类小分子化合物研究的关键。
　　 基于以上文献报道，我们拟从以下两方面进行研究:
　　 一、基于Arg61结合靶穴的化合物库虚拟筛选，并对虚拟筛选打分较高的化合物进行病毒活性测试。对活性化合物进行作用机制研究，并对活性化合物进行结构修饰，以期得到活性更好的化合物。
　　 二、基于Phe43结合靶穴的化合物结构改造及活性筛选。主要是以NBD-556为先导物，对其进行结构分析，并设计合成系列类似物，对合成的类似物进行抗HIV活性测试。总结其构效关系，以期发现广谱、高效的小分子化合物。
　　 方法:
　　 对文献报道的gp120-VRC01复合物的单晶结构进行分析。VRC01的广谱中和活性与其CDR H2的Arg61能插入到gp120上V5与β24序列围成的空腔（Arg61靶穴）有关，我们首先在曙光W580I桌面超级计算机上，采用分子动力学模拟，运用MM-PBSA方法计算gp120与Arg61（位点1）以及VRC01的58-61序列（位点2）的结合自由能。利用分子对接方法，从库容为40000的IBS天然产物数据库中虚拟筛选能与gp120上的位点1和位点2结合的化合物，并进一步计算gp120与这些化合物的结合自由能变化。对结合自由能降低较大的化合物进行抗HIV假病毒及真病毒的活性筛选，确定先导化合物。最终筛选得到化合物NC-2，并对其抑制病毒感染活性的机制进行研究。同时以NC-2为先导物，对其进行结构修饰，合成系列类似物，并进行活性筛选。
　　 (1)配体数据库:ibs2009oct_nc;受体:3NGB-A;位点1 Ag61，位点258到61号氨基酸序列。
　　 (2)用Surflex-Dock中基于配体的方法生成Protomol文件，利用分子对接技术，对ibs2009oct_nc天然产物库进行虚拟筛选，得到同时与两个位点结合打分较高的化合物。
　　 (3)计算打分较高的化合物与gp120结合的自由能变化情况，使用MM/PBSA的方法进行计算。并与ΔGgp120-VRC01和ΔGgp120-CD4进行比较。
　　 (4)对结合自由能变化较大的化合物购买，并测试其抗HIV病毒感染的活性，得到小分子NC-2候选化合物。
　　 (5)由于化合物NC-2有较好的抑制HIV假病毒与HIV-1ⅢB实验株活性，所以对其作用机制进行研究。通过细胞-细胞融合实验，病毒-细胞融合实验，时间-过程实验，判断NC-2是作用于HIV的进入阶段;通过抑制gp120与CD4的结合实验，抑制gp41六螺旋束形成实验，研究其抑制HIV进入的作用靶点。
　　 (6)以NC-2为先导物，进行结构改造，设计合成系列化合物，并进行化学合成及抗HIV活性测试。
　　 目前文献报道的NBD-556类似物的改造，其活性并没有明显提高。对NBD-556化学结构进行分析，2，2，6，6-四甲基-哌啶基及中间的草酰胺连接骨架与其活性密切相关。因此，我们拟保留四甲基哌啶基，以及中间的草酰胺连接骨架，对其R取代基进行结构修饰，连接不同取代基的芳香环及杂环，并对合成的化合物抑制HIV感染的活性进行研究。
　　 (1)以草酰二乙酯或草酰氯单乙酯为原料，通过酯的胺解反应及取代反应，合成系列NBD-556类似物。
　　 (2)对合成的化合物，进行抗HIV活性测试。
　　 结果:
　　 以Arg61结合靶穴为靶点进行虚拟筛选:分别以Arg61，58到61号氨基酸序列作为两个位点，对库容为40000的ibs2009oct_nc天然产物数据库进行筛选。先使用Surflex-Dock中基于配体的方法生成Protomol文件，使用12个CPU并行计算，其它参数使用默认值。对接得到位点1得分大于8.0的化合物113个，位点2得分大于8.0的化合物180个，其中有30个化合物既能与gp120上的位点1结合，也能与位点2结合，选取这30个化合物，进行结合自由能的计算。
　　 体系中的结合自由能的计算采用MM/PBSA与MM/GBSA的方法，分别计算了候选的30个化合物与gp120结合后的自由能差，并与ΔGgp120-VRC01和ΔGgp120-CD4相比较。gp120与Arg61（位点1）结合自由能的变化为:PBTOT=-10.67，GBTOT=-13.89。gp120与58-61序列（位点2）的结合自由能，PBTOT=-18.37，GBTOT=-16.27。其中，gp120与58-61序列的结合自由能降低值要大于gp120与Arg61结合自由能的降低值，说明58-61序列与gp120的结合能力要强于单一的氨基酸残基Arg61与gp120的结合能力。gp120与CD4的结合自由能，PBTOT=-57.95，GBTOT=-23.77。gp120与VRC01的结合自由能，PBTOT=-113.62，GBTOT=-78.88。通过计算可知，ΔGgp120-VRC01小于ΔGgp120-CD4，说明gp120与抗体VRC01的结合作用要强于gp120与CD4受体的结合，这个计算结果也能说明为什么VRC01结构与CD4类似，却具有更强效的中和能力，能阻止gp120与CD4结合。
　　 对侯选化合物与gp120结合自由能变化较大的19个化合物购买，并用假病毒体系进行抗HIV感染活性筛选。其中NC-2与NC-12有较好的抑制活性，并且这两个化合物与gp120结合自由能变化值也较大。NC-2抗HIV-1JRFL假病毒的IC50为10.58μM，抗HIV-1实验株HIV-1ⅢB的IC50为1.95μM。而且NC-2对靶细胞的毒性较小，其对U87.CD4.CCR5细胞的CC50为121.25μM，对MT-2细胞的CC50为17.23μM。NC-12虽然也具有一定的抗病毒感染的活性，但其抑制病毒感染IC50和对靶细胞毒性CC50接近，因此NC-12对细胞毒性较大。其抗病毒活性可能是由于细胞毒性引起的。
　　 对NC-2抑制HIV感染的作用机制进行研究。NC-2能抑制细胞-细胞融合，以及病毒-细胞融合，时间-过程实验进一步确认NC-2作用于HIV感染的进入阶段，且作用于HIV的包膜蛋白（统计学采用2因素析因分析方法，P＜0.001）。NC-2体外能抗gp120与CD4的结合，不能抑制gp41六螺旋束的形成（统计学采用单因素方差分析，多重比较LSD方法，P＜0.001）。说明NC-2可能是通过抑制HIVgp120与CD4的结合，从而具有抑制HIV感染的作用。
　　 NC-2是天然产物中分离得到的，其来源有限，且活性在μM级。需要对其进行结构优化，以期得到活性更好的小分子进入抑制剂。对NC-2化学结构进行分析，设计了两类化合物，并进行化学合成。其中，合成了2-(3，4，5-三甲氧基)苯甲酰基-5-(苯乙炔基)噻吩类似物9个。对其进行抗HIV假病毒活性测试，发现化合物7b和7c有抑制HIV-1JRFL假病毒感染的活性，其IC50分别为:21.36±0.78μM和15.14±6.27μM。
　　 以草酸二乙酯或草酰氯单乙酯为原料，通过酯的胺解反应及取代反应，合成系列NBD-556类似物8个。对其抗HIV活性进行测试，发现经结构改造后的化合物部分具有抗HIV假病毒感染的活性，但与NBD-556相比，活性没有明显提高。
　　 结论:
　　 以Arg61结合靶穴为靶点，通过计算机虚拟筛选辅助病毒活性测试的方法，得到小分子化合物NC-2具有较好的抗HIV假病毒与HIV-1ⅢB病毒的活性。经作用机制研究，发现NC-2是作用于HIV感染的进入阶段，且作用靶点为HIV包膜蛋白。进一步的机制研究表明，NC-2体外能抗gp120与CD4的结合，不能抑制gp41六螺旋束的形成。这与我们虚拟筛选的目的一致，说明Arg61结合靶穴是小分子化合物抗HIV感染的一个重要作用靶点。此筛选模型有一定的可信度，有可能用于其它化合物库的大规模虚拟筛选。
　　 以NC-2为先导物，进行结构改造，已合成了2-(3，4，5-三甲氧基)苯甲酰基-5-(苯乙炔基)噻吩类似物9个。活性测试结果表明，化合物7b和7c有抑制HIV-1JRFL假病毒感染的活性，其IC50分别为:21.36±0.78μM和15.14±6.27μM。另一个系列的化合物的合成也已取得了突破性的进展。对其进一步的结构优化及构效关系研究，有可能得到活性更好的小分子化合物。
　　 以NBD-556为先导物，进行结构优化，合成了NBD-556系列类似物8个，抗HIV假病毒感染的活性表明，结构改造后，化合物的活性没有明显提高。

目录

摘要

前言

第一部分 化合物库虚拟筛选及活性化合物作用机制、结构优化研究

第一章 化合物虚拟筛选及候选化合物活性检测

一、材料与仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、小结

第二章 NC-2抗HIV感染靶细胞的作用机制研究

一、材料与仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、结论

第三章 NC-2类似物的合成及活性筛选

一、材料与仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、化合物结构确认

五、小结

第二部分 NBD-556类似物的合成及活性筛选

第一章 NBD-556类似物的合成

一、材料与仪器

二、实验结果

三、实验方法

四、小结

第二章 NBD-556类似物抗HIV活性研究

一、材料与仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、结论

讨论

结论

参考文献

附录

中英文缩写词

发表论文情况

致谢

声明

统计学审稿证明