AEG--1在结直肠癌中的生物学功能及其对microRNAs表达影响的研究

摘要

背景： 结直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升趋势，严重威胁我国人民的健康。随着对结直肠癌病因和发病机制研究的深入，我们认识到人类结直肠癌的发生和发展是一个多基因多阶段改变的过程，可能与某些癌基因的激活或抑癌基因的失活有关。 星形胶质细胞升高基因-1（Astrocyte elevated gene-1，AEG-1）是人免疫缺陷病毒(HIV-1)感染或肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导人胚胎星形细胞后导致表达升高的一种基因，最初在2002年由Su等通过快速消减杂交(rapidsubtraction hybridization，RaSH)的方法克隆出来的，位于人染色体8q22。AEG-1广泛表达在许多类型的细胞，在包括结直肠癌在内的多种恶性肿瘤中高表达，目前已被证实与多种恶性肿瘤的发生发展有关，包括神经母细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、肝细胞肝癌、食管鳞癌、胃癌和结直肠癌等。 AEG-1作为一个多功能的癌基因，可以促进肿瘤增殖、扩散、转移、诱导肿瘤新生血管形成和化疗耐药等。 AEG-1通过多条信号通路参与正常细胞癌变、肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭、转移和肿瘤血管生成等肿瘤发生发展的多个环节，并能介导肿瘤细胞保护性自噬和化疗耐药。其中包括Ha-ras介导的PI3K/Akt信号通路、ERK42/44和LEF1/TCF1介导的Wnt/β-catenin信号通路以及MAPK信号通路等。AEG-1与化疗药物如5-氟尿嘧啶（5-FU）的抗性直接相关，AEG-1可以增加转录因子LSF和二氢嘧啶脱氢酶DPYD的表达。Emdad等人的实验证明:促进血管生成是AEG-1促进肿瘤侵袭和转移的机制之一，并且确定缺氧诱导因子HIF-1α是AEG-1下游的相应靶点。这些表明AEG-1通过多个信号通路在调节恶性肿瘤发病机理的各个方面均发挥着重要的作用，有针对性地抑制AEG-1的表达可能会成为一个有效的治疗癌症的策略。 microRNA是最近在人类分子肿瘤学的领域上新兴的一个研究热点，能够通过靶向蛋白质编码基因的mRNA来控制大量细胞蛋白的表达。miRNA表达的改变可能是新生肿瘤发生和发展的重要因素，它在很多肿瘤发生、发展中的担当着关键调控者的作用。基于此，我们推测AEG-1可能是通过改变miRNA的表达从而促进肿瘤的发生发展。 结直肠癌是全球常见的恶性肿瘤之一，研究发现AEG-1的表达可能与结直肠癌发展有关，AEG-1在结直肠癌中高表达，且其表达水平与UICC分级、TNM分期以及组织分化明显相关，AEG-1高表达的结直肠癌患者其总生存较差。我们前期的研究也发现，AEG-1的过表达与结直肠癌的预后有关。然而，AEG-1在大肠癌的发生、发展中的作用还没有完全清楚。在本研究中，我们分别采用shRNA干扰AEG-1表达和慢病毒介导转染高表达AEG-1建立相关细胞模型，来研究结直肠癌细胞在体外的功能及相关机制;然后采用microRNA微阵列芯片检测及筛选处理前后miRNA表达谱的改变，旨在探明AEG-1下游的靶基因或相关通路，从而为AEG-1能否作为癌症治疗的分子靶标奠定实验室基础。 目的： 分别采用RNAi干扰的方法构建低表达AEG-1的结直肠癌稳定细胞株HCT116和慢病毒转染的方法构建高表达AEG-1的结肠癌稳定细胞株SW1116，采用qRT-PCR和western blot检测细胞模型的建立是否成功，采用MTT、平板克隆、transwell和流式细胞仪等方法检测AEG-1的生物学功能，包括增殖、克隆形成、侵袭、细胞周期、凋亡、药物敏感以及与血管生成相关因子HIF-1α的关系，利用microarray检测miRNAs表达的变化，并采用qRT-PCR进一步验证AEG-1与microRNAs的关系。探究AEG-1这个基因的生物学功能和相关作用机制，为AEG-1能否作为癌症治疗的分子靶标奠定实验室基础。 方法： 1.筛选合适的结直肠癌细胞株:选取7个结直肠癌细胞株，包括Lovo、HT29、CaCO2、HCT116、SW1116、SW620和SW480细胞，于37℃5％CO2适宜湿度的无菌培养箱中培养，适时换液、传代，提取细胞总蛋白，采用Western blot方法检测7个结直肠癌细胞株AEG-1的表达水平。 2.构建和验证相关细胞模型 低表达AEG-1的HCT116模型:携带AEG-1RNAi的慢病毒载体，用慢病毒包装系统共转染包装细胞293T，包装产生慢病毒，用慢病毒对结肠癌细胞株HCT116进行感染，感染后细胞采用嘌呤霉素筛选，培养细胞提取RNA和蛋白进行qRT-PCR和Western印迹分析。 高表达AEG-1的SW1116模型:构建携带AEG-1的慢病毒载体，用慢病毒包装系统共转染包装细胞293T，包装产生慢病毒，用以感染结肠癌细胞，采用嘌呤霉素进行筛选，细胞提取mRNA和蛋白进行qRT-PCR和Western印迹分析。 3.MTT法检验细胞增殖:采用MTT的方法检测细胞增殖能力，选取4h、24h、48h和72h这4个时间点，选择570nm波长，在Synergy HT多通道酶标仪上测定各孔光吸收值。 4.平板克隆形成试验:以每孔100个细胞的密度接种在六孔板中，置37℃5％CO2培养箱中静置培养10天。10天后终止培养，固定、染色、计数，计算克隆形成率。克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100％。 5.Transwell细胞侵袭试验:Transwell小室制备包被基底膜，接种细胞至上室（10×104/ml，200ul/孔），下室加入培养基，培养24h，固定、染色、拍摄，图片采用image J分析计算。 6.细胞周期和细胞凋亡: 细胞周期:采用PI染液避光孵育30min，流式细胞仪检测。细胞凋亡:收集细胞，采用ApoScreen AnnexinⅤ Apoptosis Kit(SouthernBiotech，USA)进行染色，流式细胞仪检测。 7.细胞药物敏感实验:接种细胞，配制浓度为0、2、4、8、16、32、64uM的5-Fu药物培养液，每孔加入100ul含不同浓度5-FU的培养液培养72h。72h后采用MTT法检测，在Synergy HT多通道酶标仪上测定各孔光吸收值，计算抑制率和IC50，抑制率=（对照组OD值-给药组OD值）/对照组OD值。 8.microRNA微阵列杂交和验证:采用Trizol试剂裂解细胞，提取总RNA并纯化、定量。利用Affymetrix公司的miRNA2.0芯片，检测物种的miRNA表达谱，检测方法编号AG-AO-WL01-01-2012，数据分析方法编号AG-AO-DL01-01-2012，由博奥生物有限公司生物芯片北京国家工程研究中心完成。采用荧光定量PCR验证芯片结果。 9.采用SPSS13.0软件对实验数据进行统计分析:所有数据以(x)±s表示，符合正态分布且方差齐者采用两个独立样本t检验或One-way ANOVA检验，方差不齐采用Dunnett T3校正或t'检验，重复测量资料采用重复测量方差分析，以P＜0.05为有统计学意义。 结果： 1.AEG-1在结直肠癌各细胞株中的表达:采用Western blot方法检测结直肠癌细胞株SW1116、HCT116、SW480、SW620、Lovo、HT29和CaCO2中AEG-1的表达。AEG-1蛋白的表达水平在HCT116、SW480和SW620相对较高，而在SW1116、Lovo、HT29和CaCO2相对较低。其中，AEG-1在HCT116的表达量最高，在SW1116的表达量最低。 2.慢病毒成功转染构建稳定结肠癌细胞株:采用RNAi干扰的方法构建低表达慢病毒载体，成功感染结肠癌细胞HCT116，采用嘌呤霉素进行筛选，qRT-PCR和Western印迹证实采用RNAi干扰后AEG-1mRNA和蛋白表达水平明显下降，所设计的2条RNAi序列均能有效下调AEG-1的表达，其中以RNAi1的干扰效果更为显著(P＜0.05)。用携带AEG-1基因的病毒上清成功感染SW1116细胞，采用嘌呤霉素进行筛选，qRT-PCR和Western印迹证实转染后结肠癌AEG-1表达的上调作用显著(P＜0.05)。 3.AEG-1调控HIF-1α的表达:成功转染AEG-1的细胞，HIF-1α的蛋白表达水平也升高;敲低AEG-1的细胞，HIF-1α的蛋白表达水平也降低。表明HIF-1α的表达受AEG-1的调控，是其下游的靶基因，可能与肿瘤血管生成有关。 4.AEG-1对细胞增殖、克隆形成、侵袭及药物敏感性的作用 下调AEG-1可以抑制细胞增殖、克隆形成和侵袭能力，增强药物毒性:接种后AEG-1RNAi1可以明显降低细胞的增殖能力(P=0.021)，72h时与对照组比较降低了29.51％。下调AEG-1可以明显降低HCT116的克隆形成能力(P=0.000)，对照组的克隆形成率几乎是实验组的2倍。干扰AEG-1表达后细胞的侵袭能力明显减弱，实验组和对照组细胞侵袭的平均细胞数分别是25和245个/视野(P=0.000)。下调AEG-1后，5-FU的敏感性增加，IC50明显减少(P=0.017)，对照组和实验组的IC50分别是8.13和2.77 uM。 上调AEG-1可以促进细胞增殖、克隆形成和侵袭能力，降低药物毒性:高表达AEG-1的SW1116细胞增殖能力更快，种植48h和72h后分别是对照组的1.53倍和1.41倍(P=0.014)。上调AEG-1表达会明显提高SW1116细胞的侵袭能力(P=0.000)。高表达AEG-1对克隆形成率并没有影响(P=0.872)，但高表达AEG-1的细胞形成的单个克隆的体积更大。上调AEG-1后，5-FU的敏感性降低，IC50明显增大(P=0.023)，对照组和实验组的IC50分别是14.35和18.30 uM。 5.AEG-1影响细胞周期和凋亡:下调AEG-1会导致细胞阻滞在G0/G1期，而上调AEG-1会促进细胞进入S期。AEG-1有抑制凋亡的作用，在AEG-1RNAi1组和对照组细胞凋亡率分别是7.67％和14.97％(P=0.018)，在SW1116空载组和高表达AEG-1组细胞凋亡率分别是12.36％和6.86％(P=0.019)。 6.AEG-1的变化会影响microRNAs的表达:miRNA基因表达分析显示很多基因受AEG-1表达变化的影响，我们选择了其中5个在两组间差别均较明显的miRNA进一步分析验证，包括miR-181a-2*、-31、-9*、-193a和-193b。miR-181a-2*、-193a和-193b在SW1116 AEG-1高表达组的表达下降同时在HCT116RNAi1干扰组的表达上升，miR-31和-9*在HCT116 RNAi1干扰组的表达下降同时在AEG-1高表达组的表达上升。表明AEG-1可能通过调控这5个microRNAs的表达，调节其生物学功能，包括增殖、侵袭、凋亡和耐药，尤其在耐药方面。 结论： 1.成功构建AEG-1RNAi慢病毒载体，以AEG-1基因为靶点的慢病毒介导的RNAi技术能有效抑制AEG-1的表达;成功构建高表达AEG-1慢病毒载体，且可以显著提高AEG-1的表达;AEG-1在结直肠癌中可能通过调节HIF-1α发挥促进肿瘤血管新生的作用。 2.AEG-1可以调控结直肠癌细胞的多种生物学功能，包括细胞增殖、侵袭、凋亡、耐药和血管新生等。下调AEG-1表达会抑制肿瘤细胞增殖、克隆形成和侵袭能力，促进凋亡，增加对5-Fu的敏感性;上调AEG-1的表达会促进肿瘤细胞增殖和侵袭能力，抑制凋亡，降低5-Fu细胞毒性作用。5-FU联合转染RNAi可以有效地增加药物对细

目录

摘要

前言

第一章 结直肠癌中AEG-1的生物学功能的研究

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

第二章 AEG-1对结直肠癌中microRNAs表达的影响

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

全文总结和创新

本研究不足之处

参考文献

在读期间发表的论文

致谢

声明

统计学证明