线粒体功能障碍在海洛因海绵状白质脑病发病机制中的作用研究

摘要

背景：海洛因海绵状白质脑病(Heroin spongiform leukoencephalopathy, HSLE)是海洛因成瘾患者中出现的一种比较少见的疾病，它由荷兰人Wolters等于1982年在阿姆斯特丹首次报道;此后，海洛因滥用致使神经系统的受损愈来愈受到国内人们的重视。近年来，国内学者已对海洛因白质脑病的临床、影像、脑脊液、基因多态性、病理等方面做了深入的研究，并对该病的流行病学及病因学进行了初步研究。研究发现本病患者主要发生于烫吸海洛因的这一特定吸毒人员中，并具有以下典型的临床特征:1、均具有烫吸海洛因史，曾有过戒毒;2、急性或亚急性起病;3、以小脑损害为首发临床表现，进一步可累及椎体外系和锥体系;4、影像学显示在脑白质区出现对称蝴蝶样或类圆形的病灶，为这类患者最具特点的损害，主要分布在小脑半球、脑干、内囊后肢等;5、临床治疗上，能量合剂效果较好，激素冲击无明显疗效。 目前认为海洛因脑病为中毒性脑病的其中之一，与其它临床上常见的中毒性白质脑病有着比较相似的影像学变化，但其发病机制不清楚，而海洛因海绵状白质脑病发病机制的知晓不仅有利于提高本病治疗效果，更重要的是可以为其它中毒性白质脑病的致病机制提供借鉴和启示。由于该病较少见，病理资料缺少，病例搜集难度大，病因及发病机制研究难度相对较大。目前国内外的研究绝大多数都局限于临床资料的整理及分析，病因和发病机制研究仍为空白。但总结过去研究发现: 头颅核磁共振波谱分析显示，通过观察额叶、顶叶、枕叶白质中的肌酸、胆碱、乳酸、N-乙酰天门冬氨酸等物质代谢水平，发现病变部位的N-乙酰天门冬氨酸、胆碱、N-乙酰天门冬氨酸/肌酸、胆碱/肌酸等均低于对照组，而乳酸含量与对照组相比升高。且该病患者脑部的病灶周围影像尚未发生改变的部位已经有物质代谢改变，也就是说脑部物质代谢变化部位大于病变范围，但未见乳酸波。从上可知，海洛因脑病患者病变脑组织乳酸含量较对照组升高，提示本病可能存在脑组织有氧代谢障碍，导致需加大通过糖酵解途径使葡萄糖降解生成ATP，为大脑提供部分能量，从而导致病变部位的脑组织乳酸含量增多。 脑组织病理学研究显示，对脑标本进行常规固定、刚果红染色、苏木素-伊红染色、髓鞘染色等，HE染色发现中枢神经系统白质病变区有较多大小不一的空泡形成，海绵状改变;髓鞘染色可见白质区大量空泡退行性变，呈串珠样;电镜下发现少突胶质细胞较多空泡形成，线粒体肿胀，内质网扩张，髓鞘有较多空泡。从而得出白质广泛的脱髓改变是少突胶质细胞受损继发的髓鞘损害而不是由毒物直接损害髓鞘。 临床对照研究显示，通过将20例HSLE患者分为两组，一组予维生素B族药物及辅酶Q10治疗，另一组予再这基础上加上地塞米松20mg/d，连续用10天后逐渐减量至停药，对比两组患者治疗前后1月、半年、1年症状变化情况，两组治疗后症状均比治疗前好转，但是两组改善情况无显著差异。说明对能量合剂以及抗氧化治疗是目前有效的治疗手段，提示该病可能与线粒体能量代谢障碍有关。 细胞色素CYP2D6基因多态性与海洛因海绵状白质脑病易感性的关系研究发现，CYP2D6/C188、 CYP2D6/G4268、CYP2D6/L2938等基因的突变率高于正常人体，且有学者曾研究发现该基因与暴露在环境毒物中的中毒性脑病增加及帕金森病的危险性增高有一定联系，推测细胞色素CYP2D6与海洛因脑病有一定的关系。线粒体呼吸链复合物Ⅰ相关基因研究，通过对13513G＞A突变位行RFLP分析测定，发现野生型在Mbol限制核酸内切酶下，被切割成144、170、26bp三个片段，然而突变型由于缺少酶切位点不被完全切割，所以成两个片段。实验显示海洛因白质脑病患者46％存在着相关基因的突变。因此推断线粒体功能的缺陷部分是因13513G＞A突变引起，但是有可能存在其它的基因突变位点。基因组全序列研究发现，通过对6例海洛因白质脑病患者脑组织及外周血中线粒体的基因组全序列分析，发现了3个具有共性的突变位点，如:A5178C、A4659G和A106777G等，A5178C、A4659G位于NADH2编码的序列中，A106777G位于NADH4编码的序列中，编码的序列均涉及NADH—泛醌还原酶，而该还原酶则是线粒体有氧代谢的最重要的能量环节之一，容易受到环境中各种毒物的影响而造成线粒体能量代谢障碍。这是线粒体相关疾病的突变热区，如:线粒体复合酶缺乏症、帕金森病等，推测上诉区域在一定的毒性环境下可造成能量代谢的障碍，从而致使大脑白质的损害，在遗传背景上解释了在一定的人群中有易感性，因此推测，线粒体呼吸链受损并继发脑组织有氧能量代谢障碍可能是HSLE发病中的重要环节。 根据以上证据，推测本病可能的发病机制是:海洛因白质脑病是一种与中毒代谢性疾病相关，具有一定的遗传易感性，损害的原因是该毒物损害了少突胶质细胞线粒体的能量代谢，造成继发性大脑白质区的髓鞘脱失。通过对线粒体膜电位及呼吸链复合体Ⅰ(NADH-辅酶Q还原酶)、呼吸链复合体Ⅱ（琥珀酸-辅酶Q还原酶）、呼吸链复合体Ⅲ(辅酶Q-细胞色素C还原酶)、呼吸链复合体Ⅳ（细胞色素C还原酶）测定，以了解该病是否与线粒体功能障碍有关，以研究中毒性白质脑病发病机制。 主要研究内容包括: 1、用HE、电镜等研究手段对临床各期HSLE患者的病理学特征（白质损害）进行比较研究，特别是明确髓鞘、轴突以及少突胶质细胞三者之间的损害程度的比较分析，进一步阐明其因果关系;对海洛因脑病头颅CT及磁共振检查进行总结，与其他中毒性脑病相对比以了解有无共同之处; 2、检测HSLE患者外周血中的线粒体功能，流式细胞仪技术检测线粒体的通透性改变，探讨线粒体功能状态在HSLE发病中的作用; 3、初步阐明HSLE的发病机制，为临床治疗提供指导意见和理论依据。 目的：本研究通过上述各种临床，用实验证据验证线粒体能量代谢紊乱在HSLE发病中是否具有重要作用。检测HSLE患者外周血中的线粒体膜电位及呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，探讨线粒体功能状态在发病中的作用，有助于进一步加深我们对该病的了解及中毒性白质脑病损害机制认识。运用HE染色、少突胶质细胞染色及常规透射电镜观察，进一步明确HSLE最具本质的特征性病理学表现，并对海洛因脑病头颅CT及磁共振检查进行总结，深入比较HSLE白质损害与其他脑白质病变的差异;如条件允许，可对该病患者的外周血进行线粒体基因组全序列分析，以进一步对HSLE患者进行遗传学分析。 方法：纳入2000年3月至2012年8月门诊或曾在南方医院神经内科住院的海洛因海绵状白质脑病患者(HSLE组)及在我院体检的健康体检者（对照组，无成瘾性药物使用史）各36例。分别检测两组人员肘静脉血的线粒体呼吸链复合体Ⅰ（NADH-辅酶Q还原酶）、Ⅱ（琥珀酸-辅酶Q还原酶）、Ⅲ(辅酶Q-细胞色素C还原酶)、呼吸链复合体Ⅳ（细胞色素C还原酶）、线粒体膜电位及病理学技术。线粒体膜电位测定采用流式细胞仪技术，对比左上象限和右下象限荧光的强度来反映样本中淋巴细胞线粒体的膜电位状况;线粒体呼吸链复合体损伤测定采用酶联免疫分析方法，与正常对照组相比较来分析海洛因白质脑病患者线粒体功能情况;运用病理学技术如HE染色、少突胶质细胞染色等，常规透射电镜观察髓鞘和少突胶质细胞超微结构;对该疾病进行影像学方面的研究及总结，如头颅CT、磁共振检查。 1、线粒体膜电位测定: 测定方法:先溶血然后分离纯化得到白细胞，再用荧光探针JC-1对白细胞线粒体进行标记及流式细胞仪检测，线粒体膜电位经流式细胞仪检测后出现JC-1荧光强度的变化流式图，JC-1在线粒体内成聚合物以红色荧光为主。膜电位去极化异常的线粒体内成单体以绿色荧光为主。然后将得到的白细胞流式图设置卡门，将白细胞中的淋巴细胞提取出来，再用密度图来分析:将图像十字线划为四分，左上象限代表红色荧光线粒体，而右下象限代表绿色荧光线粒体，对比左上象限和右下象限荧光的强度能反映样本中淋巴细胞线粒体的膜电位状况。 2、线粒体呼吸链复合体损伤测定: 测定方法:采用酶联免疫分析方法，应用双抗体夹心，加底物TMB显色，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值）。通过上述方法分别测定36例HSLE与正常对照者外周血白细胞线粒体呼吸链复合物活性的吸光度，并比对标准曲线，计算样品中人线粒体呼吸链复合体Ⅰ（NADH-辅酶Q还原酶）、Ⅱ（琥珀酸-辅酶Q还原酶）、Ⅲ（辅酶Q-细胞色素C还绵状白质脑病原酶）、呼吸链复合体Ⅳ（细胞色素C还原酶）浓度，并与正常对照组相比较，以分析海洛因脑病患者线粒体功能。 3、病理学及影像学技术: 测定方法:病理组织标本行常规5um厚度石蜡切片，分别进行HE染色、甲苯胺蓝尼氏体染色、Cajal神经细胞染色、髓鞘染色（Loyes染色、Luxol fast blue染色、固绿髓鞘染色）、变性髓鞘染色（锇酸—a萘酸染色以及常规Marchi染色）、少突胶质细胞染色（Weil-Davenport染色）。常规透射电镜观察，主要观察髓鞘和少突胶质细胞超微结构。 影像学上CT成像运用CT机以OM线为基准间隔10 mm连续扫描。MRI成像运用MRI仪，以标准头部成像体位进行冠状、矢状及轴状三平面扫描，扫描序列为T1WI、T2WI快速自旋回波序列(TSE)，长T1快速反转恢复序列(FLAIR)。 结果： 1、影像学及病理学结果: 头颅CT示:双侧小脑、基底节及皮层下白质广泛低密度，小脑中线两侧白质呈对称性边界清楚的蝴蝶样低密度病灶。头颅MRI示:双侧小脑、内囊、枕顶叶深部等处白质广泛、基本对称异常信号，严重病例脑干有对称性异常信号。病理表现:HE染色光镜下观察到从灰白质交界处向白质空泡逐渐增多，白质区大量大小不均空泡形成，中枢神经系统白质呈海绵状改变。电镜下观察到少突胶质细胞大量空泡退行性变，线粒体肿胀，内质网扩张，髓鞘有空泡，很多部位髓鞘被涡轮状空泡裂解。 2、HSLE组与对照组线粒体膜电位比较: 与对照组比较，两组年龄、性别水平比较，无明显差异，差异均无统计学意义(P＞0.05)。与对照组比较，HSLE组左上象限和右下象限荧光的强度之比较正常组较大，(0.18±0.05)VS(0.24±0.07)，t=3.893，P＜0.001，差异具有统计学意义，而左上象限代表红色荧光线粒体，右下象限代表绿色荧光线粒体，红色荧光线粒体代表线粒体膜电位较高，绿色荧光线粒体代表线粒体膜低时，由此结果表示HSLE组线粒体膜电位活性较正常组明显下降，存在线粒体功能障碍，这可能是海洛因脑病患者发病的原因。 3、HSLE组与对照组线粒体呼吸链复合物Ⅰ比较HSLE组患者VS对照组:HSLE组线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性结果VS对照组分别为5.6±2.4U/ml VS4.2±2.1U/ml。 统计学结果表明，与对照组比较，HSLE组线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性活性降低(t=2.634，P＜0.05)，存在线粒体功能缺陷，线粒体功能障碍在海洛因脑病发病过程中可能起到重要作用。 4、HSLE组与对照组线粒体呼吸链复合物Ⅱ比较: HSLE组患者VS对照组:正常对照组和病患组线粒体呼吸链复合物Ⅱ活性不符合正态分布，经Wilcoxon W检验统计量为957.5，Mann-Whitney U统计量为291.5，Z=-4.015.P＜0.001。 统计学结果表明，与对照组比较，HSLE组线粒体呼吸链复合物Ⅱ活性活性降低存在线粒体功能缺陷，线粒体功能障碍在海洛因脑病发病过程中可能起到重要作用。 5、HSLE组与对照组线粒体呼吸链复合物Ⅲ比较: HSLE组患者VS对照组:HSLE组线粒体呼吸链复合物Ⅲ活性结果VS对照组分别为分别为值17.42±4.02U/ml和21.75±5.15U/ml。 统计学结果表

目录

摘要

前言

实验流程图

第一部分 海洛因海绵状白质脑病影像学及脑组织活检检查

材料和方法

结果

讨论

结论

第二部分 海洛因海绵状白质脑病线粒体膜电位测定

材料和方法

结果

讨论

结论

第三部分 海洛因海绵状白质脑病呼吸链复合体损伤测定

Ⅰ、呼吸链酶复合体Ⅰ活力测定

材料和方法

结果

讨论

Ⅱ、呼吸链酶复合体Ⅱ活力测定

材料和方法

结果

讨论

Ⅲ、呼吸链酶复合体Ⅲ活力测定

材料和方法

结果

讨论

Ⅳ、呼吸链酶复合体Ⅳ活力测定

材料和方法

结果

讨论

结论

全文总结

创新、展望与不足

参考文献

中英文缩略词表(Abbreviation Index)

论文发表情况

致谢

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