晚期蛋白氧化产物通过氧化应激诱导人近端肾小管上皮细胞转分化

摘要

肾小管间质纤维化以肾小管萎缩、细胞外基质(extracellular matrix，ECM)积聚和肾间质慢性炎细胞浸润纤维化为特征，是各种原因导致的慢性肾脏病的共同病理生理过程。其发生发展包括多个环节，如:抑制与促进纤维化细胞因子失衡、氧化应激反应增强、炎症反应、肾脏固有细胞及免疫细胞凋亡等。肾小管间质纤维化程度与肾功能进行性下降相关，并且与疾病的预后密切相关。在此过程中，肾脏组织呈不可逆的损伤，并伴随肾脏功能的逐渐下降，逐步发展至终末期肾病。 肾小管上皮细胞转分化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)是导致肾小管间质纤维化的重要因素。肾小管上皮细胞是一种极性细胞，其极性主要是由表皮黏附分子E-钙粘蛋白(E-cadherin)等细胞间紧密连接成分以及细胞与基底膜的粘附作用来维持的。多种修饰后蛋白，如脂质过氧化产物、晚期糖基化产物(advanced glycation end products，AGES)等可激活肾小管上皮细胞，增加TGF-β等致纤维化生长因的表达，诱导ECM大量合成、分泌，导致肾间质纤维化。2002年，Iwano等学者成功建立单侧输尿管梗阻(unilateralureteric obstruction，UUO)小鼠模型，该小鼠肾小管上皮细胞能特异性表达LacZ，通过LacZ基因表达示踪细胞的来源，发现约36％的间质成纤维细胞由被激活的肾小管上皮细胞EMT而成，转分化后的肾小管上皮细胞获得分泌ECM的功能，合成、分泌ECM增多，但降解减少，ECM数量明显增多，最终导致肾间质纤维化。肾小管上皮细胞EMT的基本步骤包括:分化成熟的肾小管上皮细胞失去自身极性，E-cadherin表达下调或消失，细胞间紧密连接被破坏，失去原有上皮细胞表型，上皮细胞黏附特性丧失，肾小管上皮细胞迁移能力增强，从基底膜上脱落，胞浆内细胞骨架重新排列，转而表达间质细胞表型，如α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、上皮型的角蛋白(cytokeratin，CK)、波形纤维蛋白(Vimentin，Vim)等。肌成纤维细胞(myofibroblast)等肾间质细胞能合成和分泌ECM，其数量的多少被认为与肾功能进行性恶化相关，并且可作为预测疾病预后的指标之一。 晚期氧化蛋白产物(advanced oxidation protein products，AOPP)是一种新型尿毒毒素，其水平在CKD患者体内增高，并且随着肾功能的恶化而呈持续升高趋势。AOPP是氧化系统对蛋白质产生氧化损伤所形成的交联产物，主要成分是被氧化的血清白蛋白，含有双酪氨酸及羰基官能团，与AGES的结构相似。大量研究结果表明AOPP是氧化应激的产物，具有氧化应激活性，通过引起氧化应激，能导致机体免疫功能紊乱，促使多种疾病的发生发展。同时，AOPP也是一种促炎症反应介质，可以通过单核-巨噬细胞等吞噬细胞的呼吸爆发，介导炎症因子大量合成、释放，形成级联放大炎症反应，损伤血管内皮，是动脉粥样硬化发生发展的重要环节。在体外研究中，AOPP能诱导足细胞表型改变，失去E-cadherin等上皮细胞表型特征，下调足细胞特征蛋白nephrin、podocy表达，上调α-SMA等间质细胞表型特征表达，引起蛋白尿;诱导脂肪细胞内炎症反应及胰岛素抵抗，引起代谢综合征。 氧化应激(Oxidative stress，OS)是细胞内氧化与抗氧化能力的失衡，与多种疾病关系密切。其中，活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)的增多、NADPH氧化酶的活化在氧化应激引起细胞组织氧化损伤过程中发挥着重要作用。细胞发生氧化应激时，一方面，导致细胞和分子的功能紊乱，氧化产物不能被抗氧化系统及时清除，产生的大量ROS蓄积在细胞内;导致抗氧化酶的非酶糖基化增多，细胞抗氧化酶活性降低，使得机体的抗氧化能力下降;另一方面，氧化应激时，NADPH氧化酶被活化，细胞膜受损伤后，引起细胞膜液态流动性和脂质双分子层结构不稳定，导致细胞氧化损伤，生物膜的脂质过氧化，细胞内蛋白和酶变性，造成DNA损伤。此外，蓄积的ROS能促使脂质过氧化，蛋白质硝基化，脂质和蛋白质的氧化产物与受体结合，介导新的氧化应激反应，造成恶性循环。同时，ROS作为第二信使激活信号转导级联途径和转录因子，导致核因子-κ B(nuclear factor-κ B，NF-κ B)激活，进一步加剧氧化应激状态。增多的ROS激活Src酶，使得维持细胞极性的钙黏蛋白所连接的p120-catenin酪氨酸磷酸化作用增强并移位，随后通过Rho/Rho通路破坏细胞间连接。 ROS来源广泛，多种酶系统均可合成，其中主要包括NADPH氧化酶系统。研究发现，蛋白尿、高糖条件等多种因素均可诱发氧化应激，激活肾小管上皮细胞内的NADPH氧化酶系统，以NADH作为底物，NADHP提供电子，产生O2-，通过激活PKC、(己)糖胺、多元醇、AGEs等信号转导通路，活化肾小管上皮细胞，从而导致ROS合成、分泌增多;大量的ROS产生、蓄积，调节PKC、丝裂原活化蛋白激酶和各种细胞因子、转录因子的表达，导致ECM基因表达上调;同时，激活的肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)进一步加重ROS诱导的肾损伤。另据研究表明，转化生长因子β1(transforming growingfactor-β1，TGF-β1)等致纤维化因子刺激大鼠肾小管上皮细胞后，细胞内ROS产生增加，同时NADPH氧化酶亚单位表达显著上调，而给予NADPH氧化酶抑制剂DPI则能阻断这种现象。 ROS半衰期极短，体外检测困难。但是，丙二醛(MDA)这种氧化应激过程中产生脂质代谢物，化学性质稳定，体外检测方便，可以作为评价氧化应激的良好指标。此外，此外抗氧化酶超氧化氧歧化酶(SOD)活力、过氧化氢酶(CAT)活力、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)活力也能较好地评价氧化应激的抗氧化能力。 在本实验中，利用次氯酸氧化BSA制备AOPP，以人近端肾小管上皮细胞（HK-2细胞株）作为靶细胞，给予不同浓度AOPP刺激，通过氧化应激诱导肾小管上皮细胞转分化，观察细胞表型蛋白α-SMA、E-cadherin及其对应mRNA表达的变化，并检测氧化应激指标(MDA含量、SOD活力、CAT活力及GSH-px活力)的变化;并观察使用NADHP氧化酶抑制剂DPI、氧自由基清除剂C-SOD预处理后，AOPP诱导HK-2细胞发生氧化应激、EMT的变化情况，从而探讨AOPP对肾小管上皮细胞EMT的影响及作用机制，为进一步抑制肾小管上皮细胞EMT、防治肾间质纤维化提供新的实验依据。 一、研究目的 观察人近端肾小管上皮细胞（HK-2细胞株）在AOPP刺激后，表型蛋白α-SMA、E-cadherin及其对应mRNA的变化、氧化应激指标的变化;观察使用NADHP氧化酶抑制剂DPI、氧自由基清除剂C-SOD预处理后， AOPP诱导HK-2细胞发生氧化应激、EMT的变化情况。 二、研究方法 1、AOPP的制备 按1∶140的摩尔比例，将无内毒素牛血清白蛋白(BSA)与次氯酸混合，室温下放置30min，加入PBS透析24h去除残留的次氯酸，所得样品用Detoxi-Gel凝胶柱去除内毒素。AOPP含量根据分光光度计OD340测定。 2、人近端肾小管上皮细胞株HK-2的培养 HK-2细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养液中孵育(37℃、5％CO2)。观察细胞长至80％以上融合时，胰酶消化后接种至6孔培养板继续传代培养，待细胞长至约70％-80％时用于后续实验。 3、AOPP对HK-2细胞α-SMA、E-cadherin表达的剂量依赖效应 给予不同浓度AOPP(50、100、200、400μ g/ml)与细胞共同孵育24h，50μ g/ml BSA作为阴性对照组。收集细胞样本，分别采用Western blot和Real TimeQuanti tati ve PCR(RT-qPCR)检测α-SMA、E-cadherin的蛋白和mRNA表达量。 4、AOPP对HK-2细胞α-SMA、E-Cadherin表达的时间依赖效应 以200μ g/ml AOPP、50μ g/ml BSA与细胞分别孵育不同时间(30min、1h、3h、6h、12h、24h)，收集细胞样本，分别采用Western blot和RT-qPCR检测α-SMA、E-cadherin的蛋白和mRNA表达。 5、AOPP及抑制剂预处理对HK-2细胞氧化应激的影响 分别用200μ g/ml AOPP、50μ g/ml BSA以及以100μ mol/L DPI或200U/mlC-SOD预处理1h后再加入200μ g/ml AOPP刺激细胞。分别孵育30min、1h、24h后收集细胞样本，制作成细胞匀浆，按各试剂盒所示方法测定并根据公式计算出丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、过氧化氢酶(CAT)活力、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH--px)活力;24h后收集各组细胞样本采用Western blot和RT-qPCR检测α-SMA、E-cadherin的蛋白和mRNA表达量。 三、结果 1、AOPP对HK-2细胞α-SMA、E-cadherin表达的剂量依赖效应与空白对照组及BSA组相比，不同浓度AOPP与细胞共培育可显著上调α-SMA蛋白表达，下调E-cadherin表达，并且在一定范围内呈剂量依赖效应。 2、AOPP对HK-2细胞α-SMA、E-cadherin表达的时间依赖效应 与空白对照组及BSA组相比，200μg/ml AOPP刺激细胞30min即可引起E-cadherin蛋白和mRNA表达下调，12h后E-cadherin表达显著减少;6h后可见α-SMA蛋白表达上调，12h后α-SMA mRNA表达上调，说明AOPP对HK-2细胞α-SMA、E-cadherin表达呈时间依赖效应。 3、AOPP及抑制剂对HK-2细胞氧化应激的影响 与空白对照组及BSA组相比，200μg/ml AOPP刺激HK-2细胞早期即可引起MDA含量上升，SOD活力、CAT活力及GSH-px活力下降。给予NADPH氧化酶抑制剂DPI、氧自由基清除剂C-SOD能部分抑制AOPP诱导的细胞α-SMA表达上调、E-cadherin表达下调，降低MDA含量，提高SOD活力、CAT活力及GSH-px活力。 四、结论 AOPP通过氧化应激诱导人近端肾小管上皮细胞EMT，并且存在剂量和时间依赖效应;抑制NADPH氧化酶活性及增加氧自由基清除可以部分抑制肾小管上皮细胞EMT，从而延缓肾间质纤维化的进展。

目录

摘要

前言

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

结果

1．不同浓度AOPP对HK-2细胞表达α-SMA、E-cadherin蛋白的影响

2．不同浓度AOPP对HK-2细胞α-SMA、E-cadherin mRNA表达的影响

3．不同时间点AOPP对细胞α-SMA、E-cadherin蛋白表达的影响

4．不同时间点200 μg／ml AOPP对α-SMA、E-cadherin mRNA表达的影响

5．抑制剂预处理对AOPP诱导HK-2细胞表达α-SMA、E-cadherin蛋白的影响

6．抑制剂预处理对AOPP诱导HK-2细胞表达α-SMA、E-cadherin mRNA的影响

7．抑制剂预处理对AOPP诱导HK-2细胞氧化应激的影响

讨论

参考文献

英文缩写词表

攻读学位期间成果

致谢

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