肠出血型大肠埃希菌O157:H7 Tir--C在大肠杆菌和嗜酸乳杆菌中的表达研究

摘要

一、研究背景和目的： 肠出血型大肠埃希菌（enterohaemorrhagic E.coli，EHEC）O157∶H7是一种主要经消化道传播的病原菌，可引起出血性肠炎(haemorrhagic colitis，HC)、溶血性尿毒综合症(hemolytic uremic syndrome，HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(thrombotic thromobocytopenie porpura，TTP)等并发症，重者可致死亡，其感染的病死率为0％～10％。 自从Riley1983年首次报道由EHEC O157∶H7引起的出血性肠炎暴发以来，该菌引起的暴发流行不断发生并呈上升趋势，已成为全球性公共卫生问题。因此，预防和控制EHEC O157∶H7感染十分重要。目前，针对EHEC O157∶H7感染尚缺乏有效的防治方法，一般采取对症治疗。尽管EHEC O157∶H7对大多数抗生素比较敏感，但其被抗生素杀死后，可释放志贺毒素，加剧患者并发HUS的危险性。因此，对使用抗生素治疗应采取慎重态度。鉴于EHEC O157∶H7暴发流行的严重性和抗生素治疗上的困难，疫苗的研究极为重要。 EHEC O157∶H7的致病性主要体现在细菌的黏附定植力和毒素两个方面，而转位紧密黏附素受体(Translocation intimin receptor, Tir)是O157∶H7的一种重要毒力蛋白，经EHECⅢ型分泌系统（TypeⅢ secretion system, TTSS）分泌并转位进入宿主细胞，定位于细胞膜上，与紧密黏附素结合后，可引起宿主细胞多聚肌动蛋白聚合，造成黏附局部微绒毛刷状缘破坏，形成特征性的黏附和擦拭损伤(attaching and effacing lesion，A/E lesion)，即Tir在EHEC O157∶H7的定植感染过程中起着重要的作用。因此，阻断EHEC O157∶H7感染的黏附初始阶段，可避免黏附和擦拭性损伤的发生，从而终止感染。 本研究从NCBI网站GenBank上查到EHEC O157∶H7标准株EDL933转位紧密黏附素受体完整的编码区(cds)基因序列(Accession number NC002655.2)和氨基酸序列(protein id NP290261.1)，利用生物信息学在线工具和抗原表位分析软件，预测分析其蛋白结构和抗原特性，从Tir基因全长中选取抗原表位分值高的基因进行研究（命名为Tir-C）;设计特异性引物，扩增目的基因Tir-C;将目的基因连至PET-30a(+)载体上，构建重组原核表达质粒PET-30a(+)-Tir-C，转化至大肠埃希菌BL21/DE3，诱导表达和纯化重组蛋白Tir-C;将目的基因克隆入乳酸菌高效组成型表达质粒PMG36e中，获得重组质粒PMG36e-Tir-C，经电穿孔法将该重组质粒转化至嗜酸乳杆菌中，构建表达EHEC O157∶H7 Tir-C基因的重组嗜酸乳杆菌活载体疫苗;进一步用原核表达的Tir-C蛋白、表达EHECO157∶H7 Tir-C基因的重组嗜酸乳杆菌、重组嗜酸乳杆菌结合原核表达的Tir-C蛋白分别免疫小鼠，观察亚单位疫苗和重组载体疫苗的免疫原性及免疫保护性，探讨与比较预防EHEC O157∶H7感染最有效的疫苗，为发展新型疫苗提供实验依据。 二、研究方法： 1.EHEC O157∶H7 Tir基因的生物信息学分析 从NCBI网站GenBank上获得EHEC O157∶H7标准株EDL933 Tir完整的编码区基因序列和氨基酸序列;运用InterProScan分析Tir氨基酸序列;同时使用两种B细胞表位在线分析软件(http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/与http://www.cbs.dtu.dk/services/bepipred/)预测Tir蛋白的B细胞表位。 2.目的基因Tir-C的原核表达 2.1目的基因Tir-C克隆载体的构建 根据Tir基因生物信息学分析的结果，选取Tir基因全长中的一段基因作为目的片段(Tir-C)进行研究，根据该片段的基因序列设计两条引物，通过PCR，从EHEC O157∶H7广州株882364染色体DNA中扩增出Tir-C基因，克隆入T载体pMD19-T中，构建和鉴定重组克隆载体pMD19-T-Tir-C。 2.2目的基因Tir-C表达载体的构建 利用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ，双酶切重组克隆载体pMD19-T-Tir-C，回收纯化目的基因Tir-C，与经过NdeⅠ和XhoⅠ双酶切的空质粒PET-30a(+)用T4DNA连接酶进行连接，通过PCR、双酶切及测序鉴定重组表达载体PET-30a(+)-Tir-C。 2.3目的基因Tir-C的表达、纯化和鉴定 将重组质粒PET-30a(+)-Tir-C转化至BL21/DE3中，在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下表达重组蛋白Tir-C，用12％ SDS-PAGE鉴定，进一步利用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化蛋白。以抗6×His单克隆抗体稀释液为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG稀释液为二抗，通过Western blot方法，初步鉴定重组蛋白的免疫反应性。 3.表达目的基因Tir-C的重组嗜酸乳杆菌菌株的构建 3.1目的基因Tir-C的扩增 根据Tir-C基因的碱基组成及乳酸菌高效组成型表达质粒PMG36e的酶切位点，设计特异性引物，PCR扩增目的基因Tir-C。 3.2构建重组质粒PMG36e-Tir-C 将目的基因克隆入乳酸菌高效组成型表达质粒PMG36e中，获得重组质粒PMG36e-Tir-C。 3.3重组嗜酸乳杆菌菌株的构建 将重组质粒PMG36e-Tir-C，经电穿孔法转化至嗜酸乳杆菌中，构建表达EHEC O157∶H7 Tir-C的重组嗜酸乳杆菌，经革兰染色、菌落PCR、质粒PCR、双酶切、SDS-PAGE及Western blot进行鉴定。 三、结果： 1.EHEC O157∶H7 Tir基因的生物信息学分析 Tir基因全长1，677bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，共编码558个氨基酸;InterProScan分析该氨基酸序列含有三个结构和功能域，即Tir的N端、C端和与Intimin结合的M区;Bepipred分析预测有20个B细胞线性表位肽段，ABCPred分析预测有26个B细胞线性表位肽段，综合分析结果，拟取C端，即Tir基因全长中的1000bp-1674bp作为目的片段进行研究。 2.Tir-C基因的原核表达 从EHEC O157∶H7广州株882364染色体DNA中扩增出Tir-C基因，大小为675bp，与预期一致，重组质粒pMD19-T-Tir-C及重组表达质粒PET-30a(+)-Tir-C经质粒PCR、NdeⅠ和XhoⅠ双酶切和测序鉴定，证实构建成功;目的蛋白诱导表达成功，经SDS-PAGE电泳显示与理论预测的融合蛋白分子质量相符，经纯化后获得目的蛋白Tir-C。Western blot鉴定结果显示，纯化的融合蛋白在24KDa左右处出现一条特异性条带，与预期一致。 3.表达目的基因Tir-C的重组嘈酸乳杆菌菌株的构建 成功扩增出目的基因Tir-C，克隆入表达质粒PMG36e中，获得重组质粒PMG36e-Tir-C，经电穿孔法将该重组质粒转化至嗜酸乳杆菌ATCC4356中，经镜下观察细菌形态学的变化、菌落PCR、质粒PCR、双酶切、SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定，证实表达EHEC O157∶H7 Tir-C基因的重组嗜酸乳杆菌菌株构建成功。 四、结论： 1.选取的Tir-C基因抗原表位预测分值较高，大小为675bp。 2.成功构建重组克隆载体pMD19-T-Tir-C和PET-30a(+)-Tir-C原核表达载体。细菌培养物经IPTG诱导表达出重组融合蛋白，纯化得到重组融合蛋白，分子量大小为24KD左右。Western blot初步鉴定该融合蛋白有一定的免疫反应性。 3.表达EHEC O157∶H7 Tir-C基因的重组嗜酸乳杆菌菌株证实构建成功。

目录

摘要

前言

第一部分 肠出血型大肠埃希菌O157︰H7 Tir基因的生物信息学分析

1．1 实验方法

1．2 实验结果

1．3 讨论

第二部分 肠出血型大肠埃希菌O157︰H7 Tir-C基因的原核表达

2．1 材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

第三部分 表达肠出血型大肠埃希菌O157︰H7 Tir-C基因的重组嗜酸乳杆菌菌株的构建

3．1 材料

3．2 实验方法

3．3 实验结果

3．4 讨论

全文总结

参考文献

攻读学位期间成果

附录

中英文缩略词表

致谢

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