经肋间动脉移植骨髓基质细胞治疗脊髓损伤的实验研究

摘要

第一部分经肋间动脉移植骨髓基质细胞修复家兔脊髓损伤的实验研究 研究背景: 脊髓神经的不可再生已经成为共识，寻找可以修复或替代的组织再生学方法成为当下科学研究的热点。在发达国家，每年脊髓损伤(Spinal cord injury，SCI)的发病率大约在35～65人/百万人。据不完全统计，我国每年大约有1万左右的SCI新增患者，因此，SCI已经成为社会和家庭的巨大负担。 随着组织工程技术研究的深入，细胞移植治疗SCI已经成为研究的热点。骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells，BMSCs)在修复SCI方面取得了一定的疗效，但既往的研究大多采用局部注射移植、经脑脊液移植、静脉注射移植等方法进行。然而，这三种途径各有优缺点:局部注射移植虽然移植的干细胞定植率高，细胞损失极少，但需要在术后再次暴露脊髓，存在了二次损伤、脊髓内传导束破坏、增加脊髓出血感染风险等缺点，如果脊髓内有多个病灶同时存在，则难以实现，其临床可操作性较差;经脑脊液移植借助脑脊液与脊髓表面的长期接触，不需要切开局部皮肤，可长期置管灌注，但是同样存在局部感染、神经根损伤等风险，对于高位SCI手术危险性大，并发症多。静脉注射显然能避免很多不必要的损伤，便于临床开展，但面临了细胞迁移途径较长，容易被稀释，必须通过血-脑（脊髓）屏障，到达损伤局部的更是微乎其微，容易出现微循环栓塞等弊端。为此，寻找一种更适合临床应用，且能兼具安全、微创、简便、可操作性性强、细胞定植率高等优点的移植途径十分必要。Syková和Moviglia等人分别采用颈（椎）动脉或脊髓供血动脉移植干细胞治疗急慢性SCI，且取得了满意的临床疗效，且本课题组在过去的研究中已经证实脊髓供血动脉之一的肋间动脉可以作为SCI后干细胞移植路径。且经该途径移植具备以下优点:可选择治疗节段，拥有传送大量细胞的能力，较静脉移植而言，传输路程短、相对损失的细胞数量少，对脊髓周围神经组织的干扰比较小，可以重复移植，避免局部感染的可能。 本实验采用脑动脉瘤夹建立胸段脊髓钳夹伤模型，通过全骨髓培养法获取BMSCs，将荧光标记后的BMSCs经左侧肋间动脉移植入动物模型体内。通过对模型动物肢体的运动功能恢复情况和脊髓切片组织形态学变化进行观察，研究BMSCs经肋间动脉移植治疗SCI的效果。为临床上采用肋间动脉途径移植BMSCs治疗SCI提供理论依据。 研究目的: 为对肋间动脉途径移植BMSCs修复SCI进行更为客观的评价，我们通过对SCI模型家兔的行为对比及相关病理生化指标检测，探讨经肋间动脉移植BMSCs对家兔SCI后神经修复的影响。 研究方法: 采用全骨髓贴壁培养法培养并收集BMSCs，对第3～4代BMSCs进行PKH26标记备用。按随机数字表法将成年新西兰家兔分为假手术组、损伤对照组和BMSCs治疗组，每组10只。损伤对照组及BMSCs治疗组家兔采用动脉瘤夹钳夹法建立SCI模型，假手术组家兔仅咬除椎板，不损伤脊髓。1w后BMSCs治疗组在家兔左侧肋间动脉注射BMSCs，损伤对照组注射等量生理盐水。分别于损伤后1d、1w、2w、4w对所有家兔进行BBB评分，并于第4w末对损伤部位进行取材做组织切片，观察SCI的修复及BMSCs在脊髓内的迁移和分布情况。 研究结果: 培养获取的细胞形态呈长梭型、成纤维样生长，经流式细胞仪鉴定符合BMSCs形态特征。SCI后不同时间点假手术组BBB评分明显高于损伤对照和BMSCs治疗组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。SCI后2w、4w，BMSCs治疗组BBB评分均较损伤对照组明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。脊髓组织切片HE染色显示BMSCs治疗组和损伤对照组均可见夹闭脊髓段严重变形，脊髓组织结构紊乱，神经细胞崩解、界胶质细胞增生、瘢痕组织形成。假手术组脊髓结构正常，未见明显胶质细胞增生和胶质瘢形成。BMSCs治疗组胶质瘢痕及空洞数量少于损伤对照组。Nissl染色显示假手术组轴突呈眼状梭型粗颗粒，胞体和突起轮廓清晰、胞核深染，数量较多，形状较为典型，损伤对照组和BMSCs治疗组粗颗粒状降解明显，着色神经元较少。损伤对照组碎裂最多，神经元数量明显减少，尼氏体模糊或消失，胞体塌陷皱缩、碎裂，明显少于BMSCs治疗组。损伤对照组、BMSCs治疗组NF200着色阳性细胞数及GFAP阳性染色面积均较假手术组明显增加(P＜0.05)。其中，BMSCs治疗组NF200阳性细胞数[（57.88±9.76）％]明显高于损伤对照组[（21.25±4.50）％](P＜0.05);同时BMSCs治疗组GFAP阳性染色面积[（3154.01±334.47）μm2]明显小于损伤对照组[（4536.79±686.83）μm2](P＜0.05)。免疫荧光检查发现，仅BMSCs治疗组可见受损脊髓区域聚集了大量PKH26-DAPI标记的阳性细胞，主要分布在脊髓后角及中央管后方区域。 研究结论: 1、通过全骨髓贴壁培养法成功的培养出家兔BMSCs细胞，此方法操作简单易行，且细胞增殖良好，呈成纤维细胞样生长，表达CD29、CD105，不表达CD34、CD45，可以判定获得的细胞为BMSCs; 2、通过肋间动脉注射可使移植BMSCs有效迁移至相应供血脊髓内，是治疗SCI新的高效移植途径; 3、经肋间动脉移植的BMSCs移植能在宿主体内存活、聚集、迁移并分化，促进脊髓神经轴突再生，抑制胶质瘢痕形成，从而有效改善脊髓神经功能。 第二部分不同途径联合移植骨髓基质细胞-硫酸软骨素酶治疗家兔脊髓损伤的疗效比较 研究背景： 单一手段治疗脊髓损伤（Spinal cord injury, SCI）的疗效并不是很理想，这与脊髓神经组织本身的再生能力较弱，损伤后局部微环境不利于轴突再生，胶质瘢痕形成的物理屏障及胶质细胞所分泌的抑制性物质形成的化学屏障等多种因素密切相关。基于此，一些用于SCI治疗的新方法和新药物与细胞联合移植也逐渐引起越来越多的学者关注。近年来大量研究证实硫酸软骨素酶(Chondroitinase ABC，ChABC)能特异性破坏硫酸软骨素蛋白多糖(Chondroitinsulfate proteoglycan，CSPG)，阻止胶质瘢痕的形成，并能调节与再生相关的蛋白基因表达，促进上行感觉投射纤维和下行皮质脊髓束轴突的再生，而且ChABC还可以恢复损伤平面以下的突触后活动，促进运动及本体感觉的功能性恢复，且其与骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells，BMSCs)联合移植可以获得较为理想的疗效。然而，为了获得细胞联合治疗的最佳效果，仍需要建立一个成功的细胞移植策略，选择理想的细胞、移植方法、剂量和移植时间等是移植前需要考虑的关键问题。 目前采用的细胞移植途径较多，每一种移植路径均具有各自优缺点。局部直接注射移植虽然效率高，但需要再次手术暴露脊髓，存在二次损伤、脊髓内传导束破坏等并发症，同时增加了脊髓感染风险。如果脊髓内有多个病灶同时存在，则更加难以操作，临床可操作性不强。同时，一些研究认为由于局部注射时过多的细胞聚集在一起导致移植区细胞密度过高、局部压力增大，移植细胞存活率反而较低。因此，大多数学者都倾向于选用经血或脑脊液传输途径移植治疗SCI，血液移植包括静脉途径和动脉途径。过去很少有报道采用何种移植途径才能更安全有效地达到损伤修复目的。 研究目的： 本实验通过建立家兔SCI模型，采用BMSCs联合ChABC的治疗方案，对比椎管内、耳缘静脉和肋间动脉三种移植途径的治疗效果，为临床上选择更安全有效的移植途径提供实验依据。 研究方法： 24只SCI家兔按照随机数字表法分为损伤对照组(IC)、椎管内移植组(IS)、静脉移植组(IV)和动脉移植组(IA)，每组6只。分别于SCI后1周经上述3种途径联合移植骨髓间充质干细胞-硫酸软骨素酶。通过动物行为学评估、神经电生理检测、荧光示踪技术及免疫组化等方法，比较4组家兔疗效差异。 研究结果： (1)改良Tarlov评分:SCI后3周，IA组Tarlov评分与IC组比较明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）;术后4周，各移植组Tarlov评分明显优于IC组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。(2)皮层感觉诱发电位潜伏期及波幅比较:SCI后第3、4周，各移植组潜伏期及波幅均优于IC组，差异有统计学意义(P＜0.05);其中SCI后4周，IS组及IA组潜伏期及波幅更优于IV组，差异有统计学意义（P＜0.05）。(3)HE染色:各组损伤处均有大量空泡形成，相对于IC组，各移植组损伤处空泡较小，并可见部分神经纤维束通过。(4)免疫组化:各移植组神经丝蛋白表达量均明显强于IC组;移植组间比较，IS组及IA组表达量明显高于IV组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。 GFAP阳性表达面积方面，各移植组均低于IC组;而IS和IA组相比IV组表达面积进一步减少，差异均有统计学意义(P＜0.05)。(5)荧光双染比较:SCI后4周，各移植组镜下均可见较多的PKH-DAPI阳性细胞。其中IS和IA组定植率相比IV组明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）;(6)组织蛋白表达比较:各移植组与IC组比较，脊髓组织内BDNF、NGF蛋白表达明显升高，GFAP、CSPG蛋白表达显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05);IS组和IA组相比较IC组而言，内BDNF表达明显升高，GFAP、CSPG表达显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05);IS组与IA组比较，BDNF、NGF蛋白表达升高，差异有统计学意义（P＜0.05），而两组脊髓组织GFAP、CSPG蛋白表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 研究结论： 1、本研究所选用的3种移植途径均能使BMSCs趋向性迁移至损伤脊髓组织处; 2、本研究发现IS组与IA组的NF200表达量均高于IV组，说明2组BMSCs向神经元分化效率明显优于静脉移植，有利于脊髓轴突神经元的重建; IS组与IA组GFAP含量明显低于IV组，表明胶质细胞分化率减少，以利于胶质瘢痕的溶解，脊髓修复效果均优于静脉移植; 3、3种间接移植途径中，IS组和IA组不论是脊髓功能恢复还是组织学修复情况均优于IV组，说明缩短移植细胞到达损伤脊髓的时间或增大细胞与损伤组织的有效接触面积均可促进脱髓鞘轴突的再髓鞘化进程，提高SCI的疗效。 4、肋间动脉途径操作简便，安全可靠。

目录

摘要

前言

参考文献

第一部分 经肋间动脉移植骨髓基质细胞修复家兔脊髓损伤的实验研究

1．1 引言

1．2 材料及方法

1．3 结果

1．4 讨论

1．5 结论

参考文献

第二部分 不同途径联合移植骨髓基质细胞-硫酸软骨素酶治疗家兔脊髓损伤的疗效比较

2．1 引言

2．2 材料及方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 结论

参考文献

全文小结

综述1 骨髓基质细胞生物学特性及其移植修复脊髓损伤进展

综述2 骨链基质细胞的磁标记磁共振示踪及其移植修复脊髓损伤

中英文缩略词对照表

攻读学位期间成果

致谢

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