骨髓基质细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究

摘要

目的：尽管众多研究证实,骨髓基质细胞(BMSCs)移植能够促进脊髓损伤(SCI)实验动物的神经功能恢复,但其作用机制仍然不清。以往的研究大多集中在对BMSCs移植后在损伤脊髓内存活、迁移和分化方面的研究,没有深入探讨BMSCs如何介导脊髓损伤后修复的机制,进一步明确其治疗脊髓损伤的机制已成为重点。此外,干细胞用于中枢神经系统损伤的治疗最初目的是替代死亡和损伤的神经组织,然而,越来越多的实验证据显示,BMSCs移植到体内后,没有或只有很小比例的BMSCs显示转分化为神经细胞表型,并且对这些转分化后的神经样细胞是否具有相应的功能还没有明确的证据。因而,这不太可能是BMSCs移植的主要有益作用。因此,有研究者提出,BMSCs移植促进脊髓损伤实验动物神经功能改善不能完全用替代死亡和损伤的神经细胞来解释,其他的作用机制可能参与脊髓损伤后的修复。
　　 以往研究证实,BMSCs不但能够自身分泌包括血管内皮生长因子(VEGF)在内的多种细胞因子和生长因子,而且还能够刺激内源性脑源性神经营养因子(BDNF),神经生长因子(NGF)和VEGF等的表达。故有理由提出脊髓损伤后BMSCs移植治疗所引起的神经功能恢复,可能源于这些细胞因子和生长因子在脊髓损伤修复过程中所发挥的有益作用。而研究显示,一些细胞因子和生长因子能够诱导环氧化酶-2(COX-2)表达增加,而COX-2是环氧化酶的一种诱导型酶,以往被认为在炎症反应中发挥着重要作用。然而,近来实验研究显示,COX-2与血管生成和神经保护也关系密切,并能够诱导VEGF的表达,在创伤修复过程中发挥着积极的作用。而VEGF主要通过与其高亲和力酪氨酸激酶受体2,胎肝激酶1(Flk-1),结合而在中枢神经系统内发挥促进血管生成、神经保护和神经再生的作用。因此,本实验应用RT-PCR技术、Western Blot方法、免疫荧光和免疫组化方法,观察BMSCs移植对损伤脊髓组织内COX-2、VEGF、Flk-1基因和蛋白的表达的影响和对血管生成的作用,旨在探讨BMSCs移植促进脊髓损伤修复的可能作用与机制,为BMSCs应用于临床治疗脊髓损伤提供理论依据。
　　 材料和方法：
　　 1、骨髓基质细胞分离和体外扩增：取3周大小Wistar大鼠,雄性,体重80～100g。无菌条件取双侧股骨和胫骨,除去股骨和胫骨两端,暴露骨髓腔。然后用无菌5ml注射器从骨的一端反复注入低糖DMEM培养液冲洗骨髓腔,在另一端收集。将收集的骨髓制成单细胞悬液。然后用5ml含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液重新悬浮沉淀的细胞。吹散后调整细胞密度,将细胞稀释后按2.5x105/cm2密度接种到塑料培养瓶内,置于37℃,湿度95％和5％CO2的细胞培养箱中培养。24h后通过首次全量换液去除未贴壁的细胞,以后每隔2～3天换液一次。当细胞达到80％～90％融合时,0.25％胰蛋白酶37℃消化5min传代扩增。
　　 2、骨髓基质细胞鉴定：CD34、CD44抗体免疫细胞化学方法鉴定骨髓基质细胞。
　　 3、实验动物分组Wistar成年大鼠随机分为:假手术组、DMEM组、BMSCs组。
　　 4、脊髓损伤模型和髓内注射：参照改良的Taoka/s方法,制作大鼠胸9节段脊髓压迫损伤模型。损伤30min后,通过立体定位仪,用微量注射器将第3～4代BMSCs悬液缓慢注入到距脊髓损伤区头、尾侧各1.0mm,距中线0.5mm脊髓实质内。注射深度分别是1.75mm、1.25mm、0.75mm。每点3μL(75000个细胞),每只动物移植的细胞总数共3.0x105个细胞。依同样方法DMEM组注射等量DMEM培养液。假手术组仅暴露相应的脊髓节段,不进行脊髓压迫。
　　 5、检测方法
　　 (1)采用RT-PCR技术检测脊髓组织内COX-2mRNA、VEGF mRNA、Flk-1、mRNA的表达水平。
　　 (2)采用Westem blot方法检测脊髓组织内COX-2和VEGF蛋白的表达。
　　 (3)采用免疫荧光方法观察脊髓组织内COX-2和VEGF表达和分布情况。
　　 (4)采用免疫组织化学方法观察脊髓组织内Flk-1表达变化。
　　 (5)采用Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学染色和微血管记数方法观察脊髓组织内血管生成的情况。
　　 结果：
　　 1、原代培养的BMSCs,刚接种时细胞种类较多,大部分细胞悬浮于培养液中,后经换液去除未贴壁细胞。72h左右,贴壁细胞开始增殖并形成细胞集落,细胞常围绕集落中央呈岛状向四周分布,细胞形态多样。消化传代后,细胞增值速度加快,随着传代代数的增加,细胞形态趋于均一,多为长梭形,并呈漩涡或平行状排列生长。
　　 2、BMSCs免疫细胞化学显示第3代BMSCs呈CD34表达阴性,CD44表达阳性。
　　 3、RT-PCR结果显示,移植术后1、3、5d,BMSCs组COX-2mRNA和VEGFmRNA的表达水平明显高于DMEM组(P＜0.05);而两组Flk-1mRNA表达水平比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　 4、Western Blot结果显示,BMSCs组在移植术后不同时间点(3、7、14d),COX-2蛋白表达水平显著高于DMEM组(P＜0.05);移植术后3d,BMSCs和DMEM两组VEGF蛋白表达水平比较,差异无统计学意义(P＞0.05),而移植术后7和14d,BMSCs组VEGF蛋白表达水平显著高于DMEM组(P＜0.05)。
　　 5、免疫荧光结果显示,在假手术组COX-2和VEGF仅表达于脊髓血管,脊髓损伤后COX-2则表达在脊髓血管和神经元。VEGF则表达在脊髓血管、神经元、胶质细胞和炎症细胞。
　　 6、免疫组化结果显示,移植术后3d,BMSCs和DMEM两组Flk-1表达水平比较,差异无统计学意义(P＞0.05),而移植术后7和14d,BMSCs组Flk-1表达水平显著高于DMEM组(P＜0.05)。
　　 7、Ⅷ因子相关抗原免疫化学染色和微血管记数结果显示,BMSCs组与DMEM组相比,移植术后3和7d,两组脊髓腹侧灰质内微血管数目差异无统计学意义(P＞0.05),但术后14d,BMSCs组脊髓腹侧灰质内的微血管数目略高于DMEM组(P＜0.05)。
　　 结论：
　　 1、BMSCs移植能够增加大鼠损伤脊髓组织内COX-2mRNA和蛋白的表达水平,COX-2的表达上调可能在BMSCs修复脊髓损伤的过程中发挥积极的作用。
　　 2、BMSCs移植能够上调大鼠损伤脊髓组织内VEGF mRNA.和蛋白的表达水平,并延长VEGF蛋白表达的时间,是BMSCs修复脊髓损伤的机制之一。
　　 3、BMSCs移植对大鼠损伤脊髓组织内Flk-1mRNA的表达不具有调节作用,但能够上调Flk-1蛋白的表达,是BMSCs修复脊髓损伤的机制之一。
　　 4、BMSCs移植能够诱导大鼠损伤脊髓组织内新生血管的形成,新生血管的形成可能在BMSCs修复脊髓损伤过程中发挥重要的作用。
　　 5、BMSCs移植可能通过上调损伤脊髓组织内COX-2,VEGF和其受体Flk-1的表达,而诱导新生血管的形成。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略语

论文一 骨髓基质细胞移植对大鼠脊髓损伤后环氧化酶(COX-2)基因和蛋白表达的影响

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

论文二 骨髓基质细胞移植对大鼠脊髓损伤后血管内皮生长因子(VEGF)基因和蛋白表达的影响

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

论文三 骨髓基质细胞移植对大鼠脊髓损伤后胎肝激酶1(Flk-1)表达和血管生成的影响

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述:骨髓基质细胞和骨髓损伤修复

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