ELMO1与Nck--1--SH2结构域的相互作用促进Rac1的活化

摘要

背景：蛋白质—蛋白质之间高度有序的相互作用，决定了细胞的命运，如增殖、分化或死亡。蛋白质之间的相互作用严格控制着DNA复制、RNA转录、蛋白质翻译、大分子物质的聚集与降解，以及信号转导过程等。蛋白质相互作用是所有生物体保持正常生理功能的基础。而许多疾病的发生与蛋白质-蛋白质相互作用的改变密切相关。 许多蛋白质-蛋白质之间的相互作用是由衔接蛋白所介导。Nck家族蛋白属于一类重要的衔接蛋白。在哺乳动物中，它有两个家族成员Nck-1和Nck-2，主要由N端的三个SH3结构域和C端的一个SH2结构域组成。Nck是WASP家族蛋白的一个重要的结合蛋白。在细胞内Nck与无活性的N-WASP相互作用，当Nck与细胞表面受体结合后激活细胞内的GTP-Cdc42和PIP2，活化的GTP-Cdc42或者PIP2与WASP结合后，打破WASP的自身铰链闭合结构。而启动细胞骨架重排的关键是肌动蛋白纤维的成核反应。肌动蛋白纤维的成核反应受Arp2/3复合物的催化，而Arp2/3复合物成核活性受WASP蛋白家族成员的调控。Nck家族蛋白可以通过其SH2结构域接受细胞内、外酪氨酸磷酸激酶信号，再通过其SH3结构域与WASP-Arp2/3复合物的相互作用将信号的作用传递至细胞骨架网络，从而介导酪氨酸磷酸激酶信号对细胞形态以及细胞运动能力的调控作用。另一方面，SH3结构域还能与neural Wiskott Aldrich syndrome protein(N-WASP)，WASP-interactin protein(WIP)以及PAK丝氨酸/苏氨酸激酶等相互结合调控细胞骨架活动。 Way等通过位于牛痘病毒细胞表面的一个跨膜蛋白A36R，与酪氨酸激酶Src相互作用后活化Src，活化的Src进一步磷酸化A36R第112位点的酪氨酸，A36R通过该位点与Nck的SH2结构域结合，从而通过Nck-WASP-Arp2/3复合物引起细胞骨架的重排，促进牛痘病毒在宿主细胞内的传播。另外，有研究者证实Nck-1与受体酪氨酸激酶EGFR，PDGFR-β形成复合物，而且Nck-1的SH2结构域负责介导其间的相互作用。新近的研究发现，Src家族酪氨酸磷酸激酶可以磷酸化Nephrin位于胞内部分的三个酪氨酸位点，磷酸化的Nephrin与Nck的SH2结构域相互作用，进而通过WASP-Arp2/3复合物与细胞骨架系统相连。对足细胞足突的形成和维持具有重要作用。而敲除Nck基因，破坏Nck与nephrin之间的相互作用导致足细胞足突消失和大量蛋白尿，与芬兰型遗传性肾病综合征患者的表现完全一样。 我们通过GST-Nck-1-SH2的融合蛋白体外结合实验以及质谱分析发现13种可能与其结合的蛋白。其中包括ELMO1。ELMO1(Engulfment cell motility1)是一种进化上保守的蛋白，调控细胞运动和吞噬作用。在正常小鼠肾脏中，ELMO1在肾小管及肾小球上皮细胞有弱表达。然而在单侧输尿管结扎(UUO)模型，糖尿病肾病模型和慢性肾炎模型中则发现有明显升高。在COS细胞株中，过表达ELMO1，发现collagenI和fibronectin基因及蛋白表达显著增加。但具体机制不甚清楚。 ELMO1与Dock180形成复合物，作为Rac的GEF（鸟苷酸交换因子），特异性激活Rac1(Ras相关的C3肉毒杆菌底物蛋白)。Rac1属于小GTP酶的Rho家族的成员。Rac1广泛分布于各种组织，其上有GTP酶结合区，表现出GTP酶活性，可在活性型GTP结合形式和限制型或失活型GDP结合形式两种构象之间进行循环。在受到细胞外信号的刺激作用下，Rac1通过鸟苷酸交换因子(GEFs)可以从GDP结合形式转变成GTP结合的活化形式。在GTP酶激活蛋白(GAPs)作用下，Rac1-GTP失去一个磷酸基团，成为Rac1-GDP的失活形式。GTP酶在有活性的三磷酸鸟苷GTP与无活性二磷酸鸟苷GDP两种构象之间的循环过程起着多条信号转导通路的“分子开关”作用。正是这两种活性形式之间的转换构成了Rac1发挥生物学功能的基础。 研究表明，小G蛋白Rho家族成员在所有真核细胞中都发挥着调节细胞骨架的作用。Rac1可通过与胰岛素受体酪氨酸激酶p53(IRSp53)结合，进而与WAVE2-Abi1结合，形成Racl-IRSp53-WAVE2-Abi1复合体，导致细胞表面皱褶的减少、肌动蛋白聚合以及前端伪足的形成。TGF-β（转化生长因子β）是致肾脏纤维化过程中重要的细胞因子，其主要是通过Smad依赖通路和非Smad依赖通路。TGF-β通过Rac1-NOXs-ROS通路激活核因子NF-κB，且Rac1对NF-κB转录因子依赖的启动子起到正性调节的作用，增强靶基因的转录水平。Bakin等的研究指出，显性负性突变体Rac1N17的表达阻碍TGF-β诱导的细胞分裂原活化蛋白激酶p38与ATF2的级联激活。TGF-β刺激人肾小管上皮细胞，Rac1、ERK/MAPK激酶活化，Smad3衔接区磷酸化，collagen1的合成分泌增多。对于足细胞，Rac1活性增强，会造成足突融合，产生大量蛋白尿。而Rac1抑制剂改善糖尿病引起的足细胞足突增宽和融合，上调裂隙膜骨架蛋白nephrin表达水平，表明Rac1可以调控nephrin，从而影响足细胞的结构和功能，进一步参与DN的病理生理过程。Rac1激活配体独立的异常盐皮质激素受体，与盐敏感型高血压及肾脏损伤密切相关。总之，Rac1通过协调多种信号传导级联反应以及与特异的效应物相互作用后，可以调控细胞骨架的重构，细胞之间的粘附，细胞的运动、生长、凋亡以及一系列蛋白激酶的活化等生物学效应。因此，明确ELMO1对Rac1作用的机制，有助于我们更加详细的了解肾脏疾病的发生发展过程，最终为肾脏疾病的预防和治疗提出新的设想。 目前证实，ELMO1与Dock180始终以复合物的形式存在。但是，在正常状态下，两者均通过自身内在结构域之间的相互作用而处于一种无活性状态。在外界刺激下，ELMO1的自身抑制状态先解除，进而通过一系列反映解除Dock180的自身抑制，从而发挥活化Rac1的作用。由此可见，ELMO1的自身抑制结构的释放至关重要。ELMO的自身抑制结构是由该蛋白分子N端抑制结构域(EID)与C端的自动调节结构域(EAD)相互结合构成的。之后，学者发现在EID结构域一侧有RhoG结合活性，并证实了ELMO1与活化的RhoG能够直接结合，介导ELMO1-Dock180复合物由胞浆向胞膜转运、定位，并能促进ELMO1释放自身抑制，从而活化Rac1。废除ELMO的RBD的GTP酶结合活性，则阻止了ELMO1-Dock180复合物向膜募集以及Rac信号传导。随着研究的进展，又发现活化的RhoG能够促进ELMO1自身抑制部分释放，但不足以自身抑制完全释放，存在其他的信号通路。 另外，ELMO可以被Hck激酶磷酸化。Noriko Yokoyama等证实了能被Hck磷酸化的几个ELMO1酪氨酸位点(18，216，511，395，720)，若单点或者多点突变后，Rac1的活性均有下降，特别是ELMO1-4YF(Y18，216，511，395F)。同时发现，4YF-Dock180的相互作用比起ELMO1 WT-Dock180的相互作用并没明显改变改变。Hck能促进ELMO1酪氨酸磷酸化，Rac1的活性上调。以上提示我们ELMO1酪氨酸磷酸化对Rac1的活性变化至关重要。然而，其改变是如何影响Rac1的活性，是否ELMO的磷酸化能引起自身抑制释放，目前仍不清楚。 Nck-1包含了一个SH2和三个SH3结构域，而SH2结构域具有特异性识别酪氨酸残基的磷酸化状态，从而使包含SH2结构域的蛋白质可以定位到其它蛋白的磷酸化酪氨酸位点上。这一过程构成了信号穿过细胞膜转导入细胞的基本事件，细胞外空间的信号被受体“感知”，继而在胞内空间转化为另一种化学形式，如磷酸化的酪氨酸。酪氨酸的磷酸化状态激活了串联的蛋白-蛋白交互作用，其中包含SH2结构域的蛋白质被召集到磷酸化酪氨酸位点上。这一过程激活了一系列最终导致基因表达改变等细胞响应下游事件。 本研究选择探讨Nck-1-ELMO1-Rac1之间的相互作用，不仅可以从分子水平揭示蛋白质的功能，而且对于提示细胞生长、发育、分化和凋亡以及理解生物调控机制等生命活动规律至关重要，为探讨肾脏疾病的机理、疾病治疗、疾病预防和新药开发提供重要的理论基础。 实验结果： 一、把Nck-1-SH2结构域中的FLVRES保守序列里的精氨酸突变为赖氨酸，构建了SH2结构域突变体质粒，即R308K，其失去与磷酸化的酪氨酸结合的功能;另外把SH3结构域中成对色氨酸色氨酸的第一个色氨酸突变为赖氨酸，构建了四个SH3结构域突变体质粒，即SH3-1-，2-(W38，143K)，SH3-1-,3-(W38,229K),SH3-2-,3-(W143,229K),SH3-1-,2-，3-(W38,143,229K)，相应结构域的功能基本消失。在293T细胞株中，共转染ELMO1及Nck-1野生型或突变体质粒，通过共免疫沉淀的方法，发现R308K-ELMO1的相互作用比ELMO1-Nck-1的相互作用明显减弱，而上述Nck-1的其它突变体与ELMO1的相互作用没有明显改变。 二、以Nck-1(NCBI accession number BC006403) cDNA为模板，用PCR扩增的方法，得到Nck-1-SH2，SH31，SH32和SH33片段后，克隆到pGEX-4T-3表达载体，构建重组蛋白质粒GST-Nck-1-SH2，SH31，SH32和SH33。在BL21大肠杆菌中诱导出各片段可溶性蛋白，制备GST融合蛋白小珠，同时在293T细胞株中，过表达ELMO1，通过GST Pull down实验，发现ELMO1主要与Nck-1 SH2结构域结合，而与SH3结构域之间的结合微弱。 三、构建His-E1MO1体外重组蛋白质粒。在BL21大肠杆菌中转化，诱导，表达出不溶性蛋白。接着对不溶性的His-E1MO1蛋白进行变性纯化，透析复性后，得到纯化的His-E1MO1蛋白。最后，通过与GST或GST-Nck1-SH2融合蛋白的体外结合实验，发现GST-Nck1-SH2与纯化的His-ELMO1之间相互结合，而GST组没有结合。 四、在293T细胞株中，共转染ELMO1，Dock180，Nck-1或R308K后，通过Rac1活性实验，发现过表达ELMO1，Dock180，Nck-1的实验组比过表达ELMO1与Dock180的对照组， Rac1的活性明显上调;而过表达ELMO1，Dock180与R308K的实验组， Rac1的活性没有明显改变。 五、干扰内源性Nck-1，Rac1的活性明显下降;在干扰内源性Nck-1后转染抗siRNA干扰的外源性Nck-1的重组质粒后，Rac1的活性上调恢复;而转染抗siRNA干扰的外源性R308K的重组质粒后，Rac1的活性没有恢复。 六、在293T细胞株中，单转或共转染ELMO1，Nck-1或R308K后，通过免疫荧光的方法，发现仅转染ELMO1时，荧光定位在胞浆，而在共转染Nck-1后，ELMO1红色荧光在膜上可见，而在共转R308K时，荧光仍只在胞浆可见。 七、以ELMO1为模板，用PCR扩增的方法，得到ELMO1-495（1-495氨基酸片段相对应的碱基序列），ELMO1-△531（532-727氨基酸片段相对应的碱基序列）片段后，克隆到pcDNA3.1表达载体，成功地得到重组蛋白质粒ELMO1-495，ELMO1-△531，其分别包含EID，EAD结构域，两者共同构成ELMO1的一种“自我抑制”状态。在293T细胞株中，共转染ELMO1-495，ELMO1-△531或者Nck-1，通过分离胞浆与胞膜蛋白的实验，

目录

摘要

第一部分 探讨Nck-1与ELMO1的相互作用

前言

第二节 材料与方法

第三节 结果

第四节 讨论

第二部分 Nck-1-ELMO1相互作用促进Rac1的活性

前言

第二节 材料与方法

第三节 结果

第四节 讨论

全文总结

参考文献

读研期间主要成就

缩略语词汇表

致谢

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