胶体金免疫层析和实时荧光PCR在分枝杆菌快速检测与鉴定中的应用研究

摘要

研究背景和目的： 分枝杆菌大部分属于腐生菌，但也有一些能导致人类或动物疾病，其中结核分枝杆菌复合物(Mycobacterium tuberculosis complex，MTC)可引起结核病，麻风分枝杆菌能导致麻风病，而一些非结核分枝杆菌(Non-tuberculousmycobacteria，NTM)则能引起非结核分枝杆菌病。不同分枝杆菌在生物特性、致病特性和药物敏感性等方面均有所不同，所以分枝杆菌的鉴别、鉴定在结核病和非结核分枝杆菌病的诊断、治疗和预后中都有着至关重要的作用，找到一种适合在各级实验室推广应用的快速、简便、准确、低廉的鉴别、鉴定方法一直以来都是临床结核病实验室专家的共同心愿。 分枝杆菌传统鉴别、鉴定方法是生化反应方法，此种鉴别、鉴定方法检测周期长、操作繁琐、劳动强度大、主观性强，所以已越来越为临床实验室所诟病。其它一些表型鉴别、鉴定方法也存在一些不足之处，如气相色谱法、高效液相色谱法和质谱法操作繁琐、耗费劳力和技术要求高。分枝杆菌鉴别、鉴定的另一大类方法是分子生物学方法，主要包括探针杂交、普通聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)、实时PCR、DNA指纹和测序等。探针杂交方法能鉴定多种分枝杆菌，但需要另外的杂交探针，操作费时而且成本较高;普通PCR方法通常需要进行后续的产物分析，存在污染风险高和准确性不高的缺点;实时PCR方法操作简便、检测快速，但需要荧光标记的探针，故成本较高;DNA指纹方法需要酶切分析，也存在操作繁琐和成本较高的缺点;测序法是分子鉴定的金标准，但由于需要特殊的设备和很高的技术要求，一般难以在临床实验室开展。 上世纪末研究人员应用胶体金标记的抗MPT64单克隆抗体开发了一种用于MPT64检测的胶体金免疫层析试剂盒，并将其用于分枝杆菌培养物的检测，可达到快速鉴别MTC与NTM的目的。近年来新建立的一种基于rpoB基因扩增的双重实时荧光PCR方法，因不需要使用探针进行杂交而具备了成本低廉的优势，加上实时PCR快速简便的特点，该方法也具备代替传统生化方法用于常规临床检测的潜力。那么上述两种分枝杆菌快速鉴别方法究竟哪种性能更好？还是各具优势？如果各具优势，我们应如何在临床实验室工作中对它们进行取舍，取舍的依据以及每种取舍所带来的结果又是什么，而第一部分研究所要解决的正是这些问题。 不同DNA双链由于其序列长度和序列组成不同，产生的熔解曲线特征也不同，因而可通过熔解曲线分析进行区分。高分辨熔解曲线分析(High-resolutionmelting curve analysis，HRMA)是在普通熔解曲线分析的基础上发展起来的一种高度灵敏的DNA链分析方法，能检测到DNA链中单个碱基的替换。既然上述的双重实时PCR可通过产物的熔解曲线分析来快速鉴别MTC和NTM，那么是否可以在此基础上通过结合HRMA来进一步将NTM鉴定到种呢？rpoB基因在分枝杆菌中是单拷贝基因，而且各种分枝杆菌的rpoB基因也存在序列差异，理论上应用它来鉴定NTM可获得比多拷贝基因更好的效果，故第二部分内容主要是应用单重实时荧光PCR结合HRMA来快速鉴定NTM并评价其准确性。 分枝杆菌的鉴别和鉴定主要以培养物作为检测对象，而分枝杆菌的培养常需数周时间，如果能直接检测痰液等临床标本中的分枝杆菌，那么将大大缩短诊断和治疗的周期。结核病的发病率和患病率远高于非结核分枝杆菌病，故检测临床标本中的MTC意义更大，但当前已有的各种直接检测方法并不能完全达到MTC快速、准确定量检测的目的。如实时荧光定量PCR方法虽快速但都不能实现准确定量，主要原因是该类方法大多以多拷贝基因作为扩增靶基因。细菌的gyrB基因是一种进化速度适中的单拷贝基因，因而是一种非常理想的定量分析靶基因，所以第三部分研究尝试建立基于gyrB基因扩增的Taqman实时荧光定量PCR来快速准确检测MTC。 方法： 第一部分:首先转种16株分枝杆菌标准株和95株已经过生化鉴定的分枝杆菌临床株，然后采用胶体金免疫层析法进行检测，并提取菌落DNA进行双重实时荧光定量PCR检测，对鉴别错误的MTC菌株进行mpt64基因扩增和序列分析。以生化鉴别方法作为对照，分别评价这两种方法的敏感度(Sensitivity，Se)、特异度（Specificity，Sp）阳性预测值(Positive predictive value，PPV)和阴性预测值(Negative predictive value，NPV)，同时比较两种方法的鉴别结果是否存在差异和是否能够吻合。16种分枝杆菌标准株为MTB H37Rv、牛分枝杆菌ATCC19210、脓肿分枝杆菌ATCC19977、金色分枝杆菌ATCC23366、鸟分枝杆菌ATCC25921、龟分枝杆菌ATCC35752、偶然分枝杆菌ATCC6841、戈登分枝杆菌ATCC14470、胞内分枝杆菌ATCC13950、堪萨斯分枝杆菌ATCC12478、新金色分枝杆菌ATCC25795、不产生分枝杆菌ATCC19530、副偶然分枝杆菌ATCC19686、瘰疬分枝杆菌ATCC19981、耻垢分枝杆菌ATCC19420、次要分枝杆菌ATCC23292;95株分枝杆菌临床株包括40株NTM和55株MTC。 第二部分:首先转种14株NTM标准株（同第一部分的NTM标准株）和35株已经过生化鉴定的NTM临床株，接着提取菌落DNA并纯化，然后进行单重实时荧光PCR和熔解曲线分析，参照NTM标准株的熔解曲线特征（包括熔解温度）对NTM临床菌株进行鉴定分群。此外，对所有临床菌株进行rpoB基因扩增和序列分析，了解NTM临床株中rpoB基因的突变情况。以生化鉴定的结果作为对照，计算单重实时荧光PCR结合熔解曲线分析方法的鉴定准确率。35株NTM临床株包括:10株脓肿分枝杆菌、1株arupense分枝杆菌、1株鸟分枝杆菌、1株龟分枝杆菌、4株戈登分枝杆菌、10株胞内分枝杆菌、5株堪萨斯分枝杆菌、1株副瘰疬分枝杆菌、1株苏尔加分枝杆菌和1株溃疡分枝杆菌。 第三部分:首先转种18株标准株和100株已经过生化鉴定的分枝杆菌临床株，接着提取菌落DNA，然后对自建的Taqman探针荧光定量PCR进行优化和初步性能评价。最后分别应用商用和自建的Taqman探针荧光定量PCR对50份临床标本进行MTC检测，以商用方法作为对照进一步评价自建方法的性能，并比较两种方法的检测结果是否存在差异和是否能够吻合。18株标准株包括:MTBH37Rv、非洲分枝杆菌ATCC25420、脓肿分枝杆菌ATCC19977、爱知分枝杆菌ATCC27280、金色分枝杆菌ATCC23366、鸟分枝杆菌ATCC25921、龟分枝杆菌ATCC35752、戈登分枝杆菌ATCC14470、胞内分枝杆菌ATCC13950、堪萨斯分枝杆菌ATCC12478、不产生分枝杆菌ATCC19530、瘰疬分枝杆菌ATCC19981、耻垢分枝杆菌ATCC19420、次要分枝杆菌ATCC23292、金黄色葡萄球菌ATCC25923、肺炎克雷伯菌ATCC700603、大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853。100株分枝杆菌临床株包括52株MTC和48株NTM。 结果： 第一部分:14株NTM标准株的MPT64检测结果均为阴性，而2株MTC标准株都为阳性;在95株分枝杆菌临床分离株中，48株MTB和5株牛分枝杆菌的MPT64检测结果为阳性，被鉴别为MTC;而另2株MTB和40株非结核分枝杆菌的MPT64检测结果为阴性，故被鉴别为NTM;以传统生化鉴别方法作为对照，免疫层析法鉴别MTC与NTM的灵敏度、特异度、PPV和NPV分别为96.4％、100％、100％和95.2％。16株分枝杆菌标准株的双重实时荧光定量PCR鉴别结果完全正确。在95株分枝杆菌临床分离株中，50株MTB和5株牛分枝杆菌的PCR产物熔解峰均在88.5℃-89.5℃之间，被鉴别为MTC;而40株非结核分枝杆菌临床分离株的PCR产物熔解峰均在86℃-88℃之间，故被鉴别为NTM;以传统生化鉴别方法作为对照，双重实时荧光PCR鉴别MTC与NTM的灵敏度、特异度、PPV和NPV均为100％。以传统生化鉴别方法作为对照，胶体金免疫层析法鉴别MTC与NTM的灵敏度和NPV均低于双重实时荧光PCR，其特异度和PPV则与后者一致(均为100％)。两种方法在鉴别MTC和NTM方面的差异无统计学意义(x2=0.500，P=0.500);两种方法的吻合度非常高(κ=0.957，P＜0.001)。对两株鉴别错误的MTB临床分离株进行mpt64基因序列分析，发现存在相同的缺失突变，即43位到63位氨基酸共63个碱基的缺失。 第二部分:经生化方法鉴定为同一种分枝杆菌的NTM临床菌株，其HRMA分型结果却相差甚远。但通过Tm（Melting temperature）值分析可将14种NTM标准株分为五群，Ⅰ群包括龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌，其Tm值范围为89.15～89.4℃;Ⅱ群包括偶然分枝杆菌、新金色分枝杆菌、副偶然分枝杆菌，其Tm值范围为89.45～89.65℃;Ⅲ群包括金色分枝杆菌、鸟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、不产生分枝杆菌和耻垢分枝杆菌，其Tm值范围为89.75～90.05℃;Ⅳ群包括胞内分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌和次要分枝杆菌，其Tm值范围为90.25～90.5℃;Ⅴ群只有戈登分枝杆菌一种，Tm值范围为90.55～90.75℃。根据分群标准对35株NTM临床菌株进行鉴定分群，27株被准确分群，4株因无对应的标准株而未能被分群，故Tm值分析鉴定NTM的准确率为77.14％。对所有临床菌株进行rpoB基因序列分析，发现有15株NTM临床株存在rpoB基因突变，发生突变的碱基数为1～3个。 第三部分:应用建立的Taqman探针实时荧光定量PCR对18株标准株和100株分枝杆菌临床株进行检测，其中2株MTC标准株检测都为阳性，而12株NTM标准株和4株普通细菌标准株均为阴性;52株MTC临床株检测均为阳性，其余的48株NTM临床株则均为阴性。该方法的分析灵敏度为3×101CFU/ml，分析特异度为100％。标准曲线方程为Y=-3.365×log(X)+45.6，R2为0.999，扩增效率为98.217％。4种浓度(3×106～3×103CFU/ml) Ct值的批内CV值分别为0.61％、0.60％、0.13％和0.40％，批间CV值分别为3.4％、0.29％、0.47％、0.95％。以商用Taqman探针实时荧光定量PCR作为对照，自建Taqman探针实时荧光定量PCR定性检测临床标本中MTC的灵敏度、特异度、PPV和NPV分别为85.7％、94.4％、85.7％和94.4％。两种方法在临床标本MTC检测方面的差异无统计学意义（x2=0.250，P=1.000），吻合度较高（κ=0.802，P＜0.001）。自建方法定量检测临床标本中MTC的准确性高于商用方法。 结论： 第一部分:在鉴别MTC和NTM方面，胶体金免疫层析法和双重实时荧光PCR都具有很好的灵敏度和特异度，两者之间无差异且具有很好一致性，因此都能够常规应用于分枝杆菌临床分离株的鉴别。MTC临床株的mpt64基因突变可导致胶体金免疫层析法鉴别MTC和NTM出现错误，而双重实时荧光PCR因需要特殊仪器而不适于在基层开展，所以临床实验室需根据自身条件和标本量的大小来对这两种方法进行取舍。 第二部分:因为部分NTM临床菌株的rpoB基因发生突变，所以HRMA不适于NTM临床菌株的快速鉴定。但通过参照NTM标准株的熔解曲线特征，Tm值分析可将NTM临床株分为五群。单重实时荧光PCR结合Tm值分析的方法不能将NTM鉴定到种，而且鉴定准确率不高，仍需进一步改进和完善。 第三部分:与同样采用CFU/体积浓度的研究相比，自建Taqman探针

目录

摘要

第一章 胶体金免疫层析和双重实时荧光PCR在快速鉴别结核分枝杆菌复合物和非结核分枝杆菌中的应用比较

1．1 前言

1．2 材料和方法

1．3 结果

1．4 讨论

第二章 单重实时荧光PCR结合产物熔解温度分析在非结核分枝杆菌快速鉴定中的应用

2．1 前言

2．2 材料和方法

2．3 结果

2．4 讨论

第三章 基于gyrB基因扩增的Taqman实时荧光定量PCR在结核分枝杆菌复合物快速检测中的应用

3．1 前言

3．2 材料和方法

3．3 结果

3．4 讨论

全文总结

参考文献

缩略词

综述 Commercial MPT64-Based Tests for Rapid Identification of Mycobacterium tuberculosis Complex：A Meta-Analysis

攻读学位期间发表论文

致谢

声明

统计学证明