气管内注射TSLP中和抗体抑制哮喘小鼠气道炎症和气道高反应性研究

摘要

研究背景： 支气管哮喘是由多因素引起的，以气道高反应性(AHR)、气道炎症和可逆性气道阻塞为特征的变态反应性疾病。目前全世界约有三亿患者，中国至少有近3000万哮喘患者。据WHO估计，随着气候变暖，全球每年死于支气管哮喘和过敏症的患者有25万，而且近期哮喘的死亡率在世界范围内均呈上升趋势。近二十年来全球哮喘患病率不断上升，大约每年以1％的速度递增，其中以儿童患病率上升最为显著。哮喘的发病机制繁杂广泛，目前认为是由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病，表现为多种炎症细胞特别是嗜酸粒细胞(EOS)、肥大细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞、嗜碱性粒细胞等在气道的浸润及聚集，并分泌多种炎性介质和细胞因子。目前仍缺乏根治哮喘的方法，现有的治疗药物包括支气管扩张剂、糖皮质激素、两者的联合制剂（舒利迭、信必可）、白三烯调节剂、长效胆碱能受体拮抗剂（噻托溴胺）、IgE抗体等，但是仍然不能控制所有哮喘患者病情。另外，治疗不规范或者仅针对控制症状的治疗，造成哮喘控制良好的比率很低欧美国家只有30％，中国却低于10％。另外值得需注意的是，现有治疗方案的局限性和存在的不良反应，如激素对机体的免疫抑制缺乏针对性，长期使用激素可造成骨质疏松、高血糖、二重感染。最新研究发现吸入性糖皮质激素的应用可以增加肺炎的发病率;支气管扩张剂、白三烯调节剂针对气道炎症的下游的某个环节，不良反应包括低血钾、心动过速、心律不齐、震颤等。这些不尽人意的地方都促使我们进一步研究哮喘的发病机制，寻求更好更有效的哮喘控制甚至治愈方法。 气道炎症是所有类型哮喘的共同特征，是哮喘气道高反应性和其他临床症状的病理基础，也是应用糖皮质激素的理论基石。而气道炎症的形成机制是极其复杂的，糖皮质激素应用的靶点也是多方位的，不免会产生不必要的抑制甚至是副作用。近期研究发现胸腺基质淋巴生成素(Thymic Stromal Lymphopoietin，TSLP)在过敏性炎症包括哮喘炎症形成中具有重要地位。以往的研究关于靶向抑制气道上皮细胞表达TSLP来控制哮喘炎症的文章较少，尚无文章系统阐述抑制TSLP对于下游Th细胞分化方向的影响。因此，本实验利用OVA反复致敏激发构建哮喘小鼠动物模型，通过气道内直接注射TSLP中和抗体的方法，试图从降低支气管黏膜气道上皮细胞表面TSLP水平，从源头上改变炎症启动的微环境为研究切入点，观察Th1、Th2、Treg细胞的重要转录因子T-bet、GATA3、Foxp3的表达情况，以及检测哮喘小鼠气道反应性、分析肺组织气道炎症的变化，来初步探讨TSLP在哮喘炎症发展过程中的重要作用，探索TSLP-TSLPR下游通路，并尝试找到可用于临床的控制哮喘发病、炎症进展的新方法。 [TSLP、TSLPR在过敏性哮喘炎症形成中的作用] TSLP是一种上皮细胞衍生的细胞因子，可在皮肤、肠、肺和胸腺表达。在哮喘患者支气管上皮细胞、过敏性皮炎患者角化细胞中均可观察到大量TSLP的表达。新近研究表明，TSLP在哮喘发病机制中通过几个不同的途径发挥重要的致炎作用，TSLP不仅通过激活骨髓源树突状细胞(DC)，影响DCs与幼稚Th0细胞的相互作用，造成有利于Th0细胞向Th2细胞极化的微环境，使Th0细胞偏向Th2方向分化，进而产生大量Th2型细胞因子导致过敏性炎症。而且TSLP诱导的DCs与其他通路激活的DCs不同，它不促进Th1型细胞因子的产生;TSLP或直接作用于激活的CD4+T细胞加强Th2型过敏炎症;TSLP作用于肥大细胞引起Th2型细胞因子增多，从而介导一个不需要T细胞参与的途径来发挥其促炎症作用;而且，实验发现TSLP可以直接启动Th2分化，即使是没有DCs存在;用TSLP处理初始CD4+T细胞，同时刺激T细胞受体(TCR)可以导致IL-4的产生及Th2方向分化。 TSLP受体(TSLPR)属于造血因子受体家族成员，为Ⅰ型细胞因子受体蛋白。TSLPR只有与IL-7受体α链（IL-7Rα）共同作用时才可形成高亲和力的受体复合物，其本身与TSLP亲和力非常低。TSLPR基因敲除小鼠OVA刺激后，几乎未出现杯状细胞增生和炎症细胞浸润的情况，BALF中IL-4含量和肺组织中的IL-2、IL-4、IL-5、IL-10和IFN-γ的mRNA表达无显著变化。Balb/c小鼠肺特异性表达TSLP的转基因小鼠模型实验显示，小鼠气道表现为明显杯状细胞增生、粒细胞浸润和黏膜下纤维化，伴明显的气道高反应性和气道炎症，Th2型细胞因子和IgE水平的显著增加。新近研究发现，糖皮质激素可降低哮喘鼠TSLP、TSLPR的表达，可改变TSLP诱导的DC功能，使抗原诱导Th2反应朝Th1反应偏移，IL-4、IL-5、IL-13减少，产生IL-10和IFN-γ增加，此作用依赖于DC中OX40L的下调以及IL-12产量增加。哮喘患者的研究数据表明，哮喘气道炎症的严重程度与TSLP的表达水平呈正相关。 综上所述，TSLP-TSLPR及下游信号分子对过敏性炎症疾病（如过敏性哮喘）的发生及发展过程具有重要作用。 [Th2亢进，Th1/Th2失衡，Treg抑制] 辅助T细胞(T helper cells)在哮喘的发生发展中发挥重要作用。活化CD4+T细胞按其功能和分泌的细胞因子的不同可分为Th1、Th2、Th17、调节性T细胞(Treg)等多个细胞亚群，其中Th1、Th2是两种相互制约的效应细胞类型。CD4+CD25+Foxp+ Treg细胞常执行抑制哮喘炎症作用，是T细胞中执行炎症控制的重要执行者。Th1、Th2、Treg细胞亚群分化分别受它们各自特异的转录因子T-bet、GATA-3、Foxp3调控，三者相互作用共同决定Th0的分化趋势。而TSLP过度表达可能是引起哮喘Th1/Th2失衡和气道慢性炎症的重要原因。另外，TSLP过度表达还可以导致Treg细胞的功能下降。诸多研究表明，Th2亢进，Th1、Th2失衡是哮喘慢性气道炎症、气道高反应性的关键环节。哮喘患者BALF中Treg细胞功能受到抑制，糖皮质激素治疗后，受抑制的Treg细胞功能恢复。 经典的Th1型细胞主要分泌γ干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α)和白介素2（IL-2），还具有活化巨噬细胞和引起细胞毒作用，过分的Th1激活将会导致巨噬细胞自体免疫疾病比如麻风病或结核菌素过分反应;Th2细胞主要分泌的IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子可辅助B细胞促进IgE生成、EOS等炎症细胞分化、募集、活化和粘液的高分泌，可介导包括支气管哮喘在内的过敏性疾病的发生发展。CD4+T细胞分泌的Th2细胞因子与哮喘AHR、气道EOS浸润和活化及血清IgE增高显著相关。变应性哮喘患者血清、外周血、BALF、支气管和外周小气道粘膜中存在以IL-4、IL-5为主的Th2优势反应，且IL-4/IFN-γ、IL-5血清水平的升高与哮喘严重程度相关，并随有效治疗后下降。过敏性哮喘的标志是由Th2细胞驱动的气道炎症和气道高反应性。另外，近来研究表明Treg细胞的数量不足或功能缺陷与哮喘的发病、过敏性气道炎症密切相关。Treg细胞主要分泌抑制性细胞因子IL-10，TGF-β或直接细胞接触发挥炎症抑制和诱导免疫耐受、维持机体自身稳定的作用。Th17是近年发现的新亚群，主要分泌IL17、IL22等促炎症因子，RORγ是其重要的转录因子。Th17细胞在自身免疫中起重要的作用。 对于CD4+ CD25-淋巴细胞，hTSLP-DCs可以诱导它们分化成为CD4+CD8-CD25+ Tregs细胞，Foxp3 mRNA表达水平同自然体内的Treg细胞相同。另外的证据表面，在幼鼠胸腺组织模型中，mTSLP促进Foxp3和CD4+ CD8-CD25+Tregs细胞表达，阻断mTSLPR后这一表达被抑制。但是，TSLPR缺陷的鼠并未表现Treg细胞生成的异常。这可能是由于种属差异，但是关于TSLP抗体处理后对于其肺部Foxp3的表达情况尚不明朗。 可见，TSLP来源广泛，作用靶点分布广泛。TSLP可作用于上皮细胞、DCs、Th细胞、肥大细胞等产生各种细胞因子与趋化因子，形成倾向于Th2细胞的微环境，改变Th1/Th2比例，直接或者间接抑制Treg细胞功能，从而影响哮喘整个过敏性炎症的发展方向，促进哮喘过敏性炎症的形成。因此，我们推测通过气道内直接注射TSLP中和抗体，可以直接降低支气管黏膜气道上皮细胞表面TSLP水平，从而从源头上改变炎症启动的微环境，也即通过改变整个过敏性炎症的“基调”，来达到缓解哮喘炎症程度的目的，这有可能成为控制哮喘的一种新方法。 研究目的： 本研究旨在通过气道内注射TSLP中和抗体，以造成气道上皮微环境的改变，观察小鼠肺功能、气道炎症程度、小鼠肺组织中TSLP、TSLPR和转录因子T-bet、GATA3、Foxp3的mRNA基因表达的变化。探究TSLP在哮喘发病中的作用和途径，明确TSLP-TSLPR通路对下游Th0细胞分化方向影响。 研究对象及方法 1、将41只SPF级Balb/c雌性小鼠分组随机分成四组:正常对照组、哮喘组、对照IgG2a mAb干预哮喘组、anti-TSLP mAb干预哮喘组。每组9-11只。 2、哮喘组、对照IgG2a mAb干预哮喘组、anti-TSLP mAb干预哮喘组均采用1，7，14d反复腹腔注射OVA/Al(OH)3致敏，21、24d气道注射药物干预，24d气道注射结束2h后开始OVA溶液滴鼻(24、25、26d)+雾化吸入(27、28d)激发的方法建立Balb/c小鼠OVA致敏哮喘模型及其哮喘干预模型。正常对照组致敏、激发药物均为相同体积生理盐水(NS)。 3、正常对照组、哮喘组的干预药物为NS，对照IgG2a mAb干预哮喘组的干预药物为IgG2a mAb对照抗体，anti-TSLPmAb干预哮喘组的干预药物为TSLP中和抗体。 4、OVA激发后应用Buxco无创肺功能系统检测小鼠气道阻力;根据Underwood抗原激发肺部炎症改变的组织病理学评分系统对小鼠肺部炎症情况进行评分;荧光定量PCR检测小鼠肺部TSLP、TSLPR和转录因子T-bet、GATA3、Foxp3的mRNA相对表达量。 研究结果： 1、小鼠无创肺功能Penh值结果:哮喘组和对照IgG2a mAb干预哮喘组的Penh值显著高于正常对照组（p均＜0.001），前两组Penh值无显著差异(P＞0.05);与哮喘组和对照IgG2a mAb干预哮喘组相比，anti-TSLP mAb干预哮喘组的Penh值显著降低（p均＜0.001），高于正常对照组(P=0.044) 2、哮喘小鼠肺部病理切片HE染色结果:哮喘组的炎症评分（3.2727±1.4206）、对照IgG2a mAb干预哮喘组（3.5000±1.2693）的炎症评分均显著高于正常对照组（0.4545±0.5222）（P均＜0.01），前两组之间无显著差异(P＞0.05);与哮喘组和对照IgG2a mAb干预哮喘组相比，anti-TSLP mAb干预哮喘组（1.2222±0.9718）的炎症评分显著降低（P均＜0.05），与正常对照组相比无显著差异(P＞0.05)。 3、炎症介质及转录因子基因荧光定量PCR结果: (1)小鼠肺部TSLP:哮喘组和对照IgG2a mAb干预哮喘组肺组织TSLPmRNA相对表达量显著高于正常对照组（P均＜0.05），前两组之间无显著差异(P＞0.05);与哮喘组和对照IgG2a mAb干预哮喘组相比，anti-TSLP mAb干预哮喘组的TSLP mRNA相对表达量显著降低（P均＜0.05），与正常对照组相比无显著差异(P＞0.05)。 (2)小鼠肺部TSLPR:正常对照组的肺组织TSLPR mRNA相对表达量显著低于哮喘组、对照IgG2a m

目录

摘要

第一章 前言

第二章 研究对象和方法

2．1 第一节 实验对象及分组

2．2 第二节 仪器设备及相关试剂

2．3 第三节 研究方法

2．3．1 第一小节 构建哮喘小鼠动物模型

2．3．2 第二小节 小鼠无创肺功能检测

2．3．3 第三小节 小鼠处死取材及肺病理切片制作

2．3．4 第四小节 提取小鼠肺组织mRNA并转逆转录为cDNA

2．3．5 第五小节 荧光定量PCR检测TSLP、TSLPR、T-bet、GATA3、Foxp3的mRNA相对表达量

第三章 实验结果

3．1 第一节 哮喘小鼠模型构建及无创肺功能结果

3．2 第二节 小鼠肺组织病理评分结果

3．3 第三节 小鼠肺组织TSLP、TSLPR、T-bet、GATA3、Foxp3的PCR结果

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

中英文对照表

攻读学位期间成果

工作研究经历

致谢

论文统计学评议书

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