FHL2参与调节KLF8促进结直肠癌侵袭转移机制的研究

摘要

目的和意义：
　　FHL2(Four and a half LIM Protein2)为确定的癌基因，在胃肠道肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用。我们通过软件筛选出转录因子KLF8(Kruppel-like factor8)为FHL2可能的调控因子。Kruppel-like factor8(KLF8)是作为Kruppel样Cys2/His2锌指转录因子蛋白质家族的一个转录抑制蛋白而被识别的，通过与辅抑制子碳端结合蛋白(CtBP)相联系抑制基因表达。最近有研究表明KLF8在卵巢癌、肾癌以及乳腺癌中表达是升高的，但是在肠癌组织细胞中的表达及其与肠癌发生、侵袭转移尚无相关报道。同时本课题旨在明确KLF8与FHL2上游启动子序列的转录调控关系，从而寻找能靶向调控FHL2表达的元件，以期应用于肿瘤的生物靶向治疗。
　　材料和方法：
　　主要材料：
　　Lovo、SW480、SW1116、Caco2、SW620、HT29和DLD1细胞，rTGF-β1、TGF-β1中和抗体、双荧光素酶报告基因检测试剂盒、CHIP试剂盒、突变试剂盒、KLF8抗兔多克隆抗体、FHL2抗鼠多克隆抗体、罗丹明标记鬼笔环肽。
　　主要方法：
　　1.KLF8对肠癌EMT及侵袭转移的影响
　　KLF8过表达稳定株的构建及KLF8对肠癌EMT的影响
　　转染pcDNA3.1-KLF8和对照pcDNA3.1质粒到Lovo细胞，48小时后用含有600μg/mlG418的培养基继续培养2周，挑选单克隆细胞，并用800μg/ml G418培养基继续培养，建立单克隆稳定表达株，western blot验证稳定克隆细胞中KLF8的表达情况。western blot检测转染pcDNA3.1-KLF8和对照pcDNA3.1质粒细胞中的E-cadherin、Vimentin及N-cadhenrin的表达情况。
　　2.KLF8和FHL2在原发性肠癌、转移癌组织及细胞内的表达情况
　　2.1 KLF8和FHL2在原发性肠癌及转移癌组织中的表达
　　收集15对以上来自同一肠癌病人的原发与转移癌（淋巴结或肝转移）手术标本，在连续切片中分别应用KLF8和FHL2抗体进行免疫组织化学染色。
　　2.2 KLF8和FHL2在肠癌细胞内的表达提取Lovo，SW1116，SW620，HT-29，DLD1，CaCo2，SW480的细胞蛋白，用western blotting技术检测不同肠癌细胞中KLF8和FHL2的表达水平，并间接免疫荧光染色方法检测KLF8与FHL2两蛋白的细胞内亚分布。
　　3.KLF8与FHL2的关系
　　3.1 FHL2启动子区域内KLF8的结合位点
　　通过使用生物信息学软件预测FHL2启动子区域内的KLF8结合位点，为了获得更多KLF8与FHL2启动子结合的证据，我们利用染色质免疫共沉淀(CHIP)的方法，探索FHL2启动子区域内KLF8的结合位点。
　　3.2 双荧光素酶检测FHL2启动子区域内KLF8结合位点的活性根据FHL2启动子(500bp)内KLFs的位置设计三对引物，扩增FHL2基因5'端上游启动子序列，分别插入到pGL3-Basic载体，构建质粒pluc55、pluc201和pluc498，瞬时转染入不同KLF8表达状态的肠癌细胞，进行双荧光素检测。
　　4.下调FHL2对KLF8诱导的结直肠癌EMT的影响及其对KLF8诱导的结直肠癌增殖、侵袭转移能力的影响
　　4.1 FHL2低表达对KLF8诱导的EMT的影响在KLF8过表达稳定株（Lovo-pcDNA3.1/Lovo-pcDNA3.1-KLF8）中，瞬时转染Scr-RNA或FHL2-siRNA，48小时后，western blot检测FHL2、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin表达;另外用免疫荧光染色实验观察E-cadherin和Vimentin在Lovo-KLF8-src-siRNA和SW480-KLF8-FHL2-siRNA两个细胞中分布的变化。
　　4.2 FHL2低表达对KLF8诱导的结直肠癌细胞增殖、侵袭和转移能力的影响
　　WST-1实验验证FHL2对KLF8调节的结直肠癌细胞增殖的影响在过表达KLF8稳定株(Lovo-pcDNA3.1-KLF8)中，瞬时转染FHL2-siRNA或Scr-RNA，分别种植0、24、48、72小时后的单细胞悬液于96孔板中，继续培养24小时，向每孔中加入10μl WST-1溶液，4小时后测定450nm处的吸光度。
　　5.压低FHL2表达对KLF8诱导的体内侵袭转移作用的影响
　　5.1 皮下肿瘤模型的建立给5-6周龄大小的BALB/c雌性裸鼠皮下分别注射转染pcDNA3.1、pcDNA3.1-KLF8、pcDNA3.1-KLF8-FHL2 siRNA的细胞，35天后处死，对比三组皮下肿瘤大小;肿瘤连续切片免疫组化验证Ki-67和CD105的表达情况。
　　5.2 脾被膜下肝转移模型的建立
　　给5-6周龄大小的BALB/c雌性裸鼠脾被膜下分别注射转染pcDNA3.1、pcDNA3.1-KLF8、pcDNA3.1-KLF8-FHL2siRNA的细胞，3周后处死，观察体内肝脏转移瘤大小;并用qRT-PCR验证三组肝肿瘤内E-cadherin的表达。
　　结果：
　　1.KLF8促进肠癌EMT及侵袭转移
　　1.1 过表达KLF8对肠癌细胞EMT的作用
　　通过western blot证实KLF8与E-cadherin呈负相关关系，与Vimentin、N-cadherin呈正相关关系。
　　1.2 KLF8对肠癌细胞侵袭转移的作用
　　划痕和侵袭实验表明KLF8表达水平与肠癌细胞的侵袭转移能力呈正相关。
　　1.3 rTGF-β1对KLF8及EMT的影响
　　肠癌细胞内KLF8的表达对rTGF-β1存在剂量依赖性，浓度越高的rTGF-β1导致KLF8的表达增高，并且降低E-cadherin而增加Vimentin的表达水平;内外源性rTGF-β1引起的KLF8表达均可以受到TGF-β1中和抗体的抑制;KLF8siRNA阻断了rTGF-β1引起的Vimentin的表达，而增加E-cadherin表达。
　　2.KLF8与FHL2在肠癌组织和细胞中的表达关系
　　KLF8与FHL2在原发性肠癌及转移癌组织中的表达
　　免疫组化实验证实KLF8与FHL2在肠癌组织中表达水平均显著高于邻近正常肠组织，且同位点胞浆和胞核内均有表达，通过Spearman分析得出二者表达呈正相关;二者在转移癌中的表达均呈阳性表达。
　　3.FHL2是KLF8转录活性的直接目标
　　3.1 FHL2启动子区域存在KLF8结合位点
　　生物信息学分析发现:在FHL2启动子500bp内存在3个GT盒子:分别位于-50～-55bp（GT盒子1），-192～-201bp（GT盒子2）和-493～-498bp（GT盒子3）。CHIP结果发现:加了KLF8抗体组内GT盒子1处有条带出现，加了对照抗体IgG和未加KLF8抗体处均未见条带出现。
　　3.2 双荧光素酶基因报告实验证明KLF8与GT盒子1结合
　　将FHL2启动子区域内的三个GT盒子接入pGL3-Basic载体中，构建重组质粒转染入Lovo-pcDNA3.1、Lovo-pcDNA3.1-KLF8中进行双荧光素酶检测，结果显示:转染含有GT盒子1质粒的高表达KLF8细胞组活性明显高于对照组，转染含GT盒子2和GT盒子3质粒的高表达KLF8细胞组与对照组细胞无明细差异。
　　4.FHL2siRNA抑制KLF8诱导肠癌细胞的EMT和肠癌细胞增殖、侵袭转移能力，并影响KLF8诱导肠癌细胞形态的变化
　　FHL2siRNA抑制KLF8诱导肠癌细胞的EMT
　　Western blot证实:在KLF8过表达稳定株中转染FHL2-siRNA可促进E-cadherin的表达，并且抑制Vimentin和N-cadherin的表达。免疫荧光实验结果同样证实:在KLF8稳定表达株中压低FHL2可促进E-cadherin的表达，抑制Vimentin的表达。
　　结论：
　　1.KLF8促进肠癌的EMT及侵袭转移活性;
　　2.FHL2和KLF8在肠癌及转移瘤组织细胞中的表达呈正相关;
　　3.CHIP实验、双荧光素酶、基因突变实验相互印证在FHL2启动子区域55bp处存在KLF8结合位点;
　　4.FHL2siRNA抑制KLF8诱导肠癌EMT和肠癌细胞增殖、侵袭转移能力，并改变其诱导的细胞形态变化;
　　5.体内实验再次印证FHL2参与调节KLF8诱导的EMT和侵袭转移。FHL2为癌基因，KLF8是正向调节肠癌的发生、发展及侵袭转移的转录因子，FHL2和KLF8的相互作用，在大肠癌EMT及侵袭转移中具有重要作用。

目录

摘要

前言

一、实验材料

1 1 细胞株

1．2 siRNA及质粒转染

1．3 组织样本来源

1．4 主要试剂

1．5 主要设备

1．6 相关溶剂的配置

二、实验方法

2．1 细胞培养

2．2 质粒转化

2．3 质粒扩增、抽提

2．4 DNA转染(以24孔板内转染为例，且以下数据以每孔为单位)

2．5 siRNA转染(以在24孔板内转染为例，且以下数据均以每孔为单位)

2．6 稳定表达细胞株的建立

2．7 细胞总蛋白的提取

2．8 BCA法测定蛋白浓度

2．9 Western blot分析鉴定蛋白

2．10 组织包埋

2．11 免疫组织化学染色

2．12 细胞划痕实验

2．13 细胞粘附实验

2．14 细胞侵袭实验

2．15 免疫荧光实验

2．16 染色质免疫共沉淀(Chip)

2．17 普通PCR反应

2．18 双荧光素酶报告基因检测

2．19 基因定点突变实验

2．20 组织中总RNA的抽提

2．21 逆转录cDNA

2．22 qRT-PCR(Real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，实时定量逆转录PCR)

2．23 慢病毒感染细胞

2．24 罗丹明-鬼比环肽染色

2．25 皮下接种肠癌成瘤

2．26 膜下肝转移模型的建立

2．27 统计学分析

三、结果

1 KLF8促进肠癌EMT及侵袭转移

2 KLF8与FHL2在原发性肠癌及转移癌的组织细胞中表达呈正相关

3 KLF8与FHL2启动子特异结合

4 FHL2siRNA抑制KLF8诱导的肠癌细胞EMT及增殖、侵袭转移能力，并影响KLF8诱导的肠癌细胞形态变化

5 FHL2低表达对KLF8诱导的体内成瘤作用的阻断

四、讨论

五、全文小结

参考文献

中英文缩略词对照表

在读期间撰写论文情况

致谢

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