晚期氧化蛋白产物对兔膝骨关节炎关节软骨及滑膜影响的实验研究

摘要

研究目的：
　　1.探讨外源性晚期氧化蛋白产物(AOPPs)对兔骨关节炎关节软骨组织大体形态的影响。
　　2.探讨外源性晚期氧化蛋白产物(AOPPs)对滑膜组织中基质金属蛋白酶表达的影响。
　　研究方法：
　　1.体外制备AOPPs修饰的兔血清白蛋白(AOPPs-RSA)。
　　将兔血清白蛋白与次氯酸溶液以摩尔比例1∶140混匀后，室温下反应30min，加入透析膜中并将透析膜在磷酸盐缓冲液中透析24小时去除游离次氯酸，将所得样品用滤器过滤去除内毒素，经鲎实验法测定内毒素含量低于0.25EU/ml。AOPPs-RSA中AOPPs含量的测定:以氯胺T为标准曲线，测定酸性条件下340nm吸光度值。最终将制备好的AOPPs稀释至0.20mg/ml后保存于-20℃冰箱备用。
　　2.实验动物的药物干预及取材。
　　购买5月龄雄性新西兰大白兔（南方医科大学动物实验中心）48只，体重2.0～2.5kg。饲养于适宜的环境中，给予充足的水与食物，严格昼夜周期。经10天适应环境后将48只雄性新西兰大白兔随机分假手术组（Sham-operated）、对照组(ACLT+MMx/PBS)和干预组(ACLT+MMx/AOPPs)，每组16只。采用膝关节前交叉韧带离断与内侧半月板部分切除术(ACLT+MMx)建立骨关节炎模型。假手术组:采用与造模手术相同的手术入路打开关节腔，显露前交叉韧带后缝合切口。对照组与干预组均采用ACLT+MMx造成骨关节炎模型。给予2周时间愈合手术伤口后，干预组行1ml AOPPs(200μg/ml)隔日关节腔内注射，对照组给予同等剂量磷酸盐缓冲液关节腔内隔日注射，假手术组不做任何处理。在关节腔注射开始4w、8w后随机取每组中的8只经麻醉后以耳缘静脉注射空气处死，分离双侧股骨及胫骨标本。关节标本的股骨与胫骨分离后剥除表面软组织，生理盐水纱布包埋后储存于-80℃冰箱备用。
　　3.检测指标:
　　(1)对膝关节标本行肉眼大体观察，取股骨髁作为组织标本，行India ink大体标本染色，并以India ink染色大体评分法对实验动物关节损伤进行评价。
　　(2)股骨髁切片行番红O固绿染色。以Mankin评分为标准，对兔骨关节炎模型关节软骨的损伤进行评价。
　　(3)取关节内滑膜组织为标本，提取滑膜组织中蛋白并通过蛋白印迹实验(Western-blot)检测滑膜组织中基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs) MMP-3与MMP-13的表达量。
　　研究结果：
　　1.AOPPs组4周和8周India ink染色大体观察评分分别为(4.19±0.60)、(5.75±0.60)，假手术组分别为(1.06±0.18)、(1.38±0.60)，磷酸盐缓冲液组分别为(2.50±0.46)、(3.06±0.62)，磷酸盐缓冲液组的India ink大体评分在两个时间点上均较假手术组高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。AOPPs组的India ink染色大体评分在两个时间点均较另外两组高，且差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
　　2.组织学观察AOPPs组4周和8周Mankin评分分别为(8.19±0.70)、(11.94±0.90)，假手术组分别为(0.75±0.53)、(1.06±0.73)，磷酸盐缓冲液组分别为(4.25±1.46)、(4.50±0.89)，磷酸盐缓冲液组的Mankin评分在两个时间点上均高于假手术组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。AOPPs组的Mankin评分在两个时间点上均高于另外两组，且差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
　　3.AOPPs组4周和8周滑膜组织中MMP-3、MMP-13相对表达量分别为(1.006±0.080)、(1.098±0.088)，假手术组分别为(0.066±0.006)、(0.053±0.011)，磷酸盐缓冲液组分别为(0.552±0.024)、(0.839±0.084)。磷酸盐缓冲液组滑膜组织中MMP-3、MMP-13的表达量在两个时间点均较假手术组高，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。AOPPs组4周和8周滑膜组织中MMP-3、MMP-13的表达量均较其它两组高，且差异均具有统计学差异(P＜0.05)。
　　研究结论:
　　外源性AOPPs刺激滑膜细胞MMP-3、MMP-13表达上调，加速软骨退变。

目录

摘要

前言

第一章 新西兰大白兔骨关节炎模型的建立及AOPPs的制备

材料与方法

结果

讨论

结论

第二章 晚期氧化蛋白产物对OA软骨大体形态的影响

材料与方法

结果

讨论

结论

第三章 晚期氧化蛋白产物对OA滑膜中MMP3、MMP13表达的影响

材料与方法

结果

讨论

结论

全文结论

参考文献

攻读学位期间成果

附录

致谢

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