类风湿关节炎患者关节液免疫复合物对成纤维样滑膜细胞功能影响的研究

摘要

目的:
　　1.取RA和OA患者关节液中提取的抗瓜氨酸化肽特异性免疫复合物(anti-citrullinated peptide antibody specific immune complexes，ACPA-ICs)，在不同IC浓度梯度下，分别对RA患者关节FLSs进行刺激，以探讨ACPA-IC对FLSs增殖功能的影响。
　　2.取RA和OA患者关节液中提取的ACPA-IC，在不同IC浓度梯度下，分别
　　对RA患者关节FLSs进行刺激，用ELISA法检测细胞上清中IL-6、IL-8、GM-CSF和MMP-3的含量，以探讨ACPA-IC对FLSs CKs和MMPs分泌功能的影响。
　　3.分别从RA和OA患者关节滑膜组织(synovial tissue，ST)提取蛋白，并对两组蛋白进行鉴定。
　　4.将从RA和OA患者ST中提取的蛋白进行western blot检测，以分析RA和OA患者ST中PADI4的表达量是否存在差异。同时，对RA患者血清抗环瓜氨酸肽抗体(抗CCP)、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、抗链球菌溶血素O(anti-streptolysin，ASO)和RF等相关实验指标进行检测，以期研究滑膜组织中PADI4的表达量与临床相关实验指标是否具有相关性。进一步探讨PADI4在RA中的致病作用。
　　方法:
　　1.采用G蛋白免疫亲和层析法，从RA患者和OA患者关节液中提取IC，BCA法检测提取后各组ICs蛋白质浓度;CLIA法检测提取后及混合前后各组IC中ACPA的浓度。
　　2.无菌条件下获取手术切除的RA患者关节滑膜组织，分离纯化FLSs，并进行体外培养，取第4～7代细胞进行实验刺激。
　　3.用纯化后的各组IC刺激RA FLSs，CCK-8法检测刺激后FLSs的增殖情况。4.用ELISA法分析IC刺激RA FLSs后细胞培养液上清中IL-6、IL-8、GM-CSF和MMP-3的分泌情况。
　　5.无菌条件下获取手术切除的RA和OA患者的关节ST，液氮研磨提取蛋白，western blot法检测ST中PADI4蛋白表达情况。
　　结果:
　　1.RA-IC刺激对RA FLSs增殖的影响
　　与对照组OA-IC组和空白对照组(BC)相比，四种浓度(25μ g/ml、50μ g/ml、100μ g/ml、200μ g/ml)的ACPA-IC刺激FLSs48h后，对FLSs增殖有一定抑制作用，且在25μ g/ml、50μ g/ml和100μg/ml三个浓度均有统计学意义(P＜0.01)，但随着浓度的升高，抑制作用逐渐减弱;OA-IC和BC组相比，对FLSs的增殖无作用。
　　2.关节液RA-IC刺激对RA FLSs分泌CKs功能的影响
　　ACPA-IC刺激FLSs24-72h后，在细胞培养上清中可测到大量IL-6、IL-8、GM-CSF和MMP-3，其水平显著高于OA-IC刺激组(P＜0.05)。其中50μ g/ml、100μ g/ml和200μ g/ml的RA-IC组刺激后，FLSs分泌GM-CSF和IL-6量均显著高于OA-IC组和BC组。RA-IC刺激FLSs分泌IL-8的作用最强，四种刺激浓度，其含量均明显高于OA-IC组与BC组，且差异显著(P＜0.01)。而MMP-3仅在RA-IC刺激浓度为100μ g/ml和200μ g/ml时，与OA-IC组和BC组存在显著性差异(P＜0.01)。提示低浓度时，关节液RA-IC对FLSs刺激MMP-3分泌作用较弱。OA-IC组与BC组间刺激作用差异并不明显，仅在低浓度时，两组MMP-3分泌水平存在些许差异。同时，三组中IL-6、IL-8、GM-CSF和MMP-3分泌水平均随着时间增加而增加，说明二者间也存在一定正相关性。
　　3.滑膜组织提取蛋白鉴定
　　分别取等量RA和OA患者滑膜组织提取蛋白混合，蛋白质定量后用于后续实验。SDS-PAGE鉴定结果显示，RA组出现若干OA组中没有的条带，在电泳图上25KDa和55KDa位置可见两条深染条带，分别为抗体Ig的轻链和重链部分。
　　4.RA、OA患者ST PADI4表达水平
　　RA患者ST的PADI4的表达水平明显高于OA患者(P＜0.05)，但未发现其表达水平的高低与患者血清中抗CCP、RF、CRP和ASO水平存在相关关系。
　　结论:
　　1.RA患者关节液中较高水平的ACPA-IC对FLSs增殖具有一定抑制作用，随刺激浓度升高抑制作用逐渐减弱，但低刺激浓度和更高刺激浓度的作用尚需进一步的实验证实。
　　2.RA患者关节液IC可刺激FLSs分泌高水平的IL-6、IL-8、GM-CSF和MMP-3，提示ACPA-IC中含有的瓜氨酸化蛋白(citrullinated protein，CitP)或ACPA可能在刺激FLSs分泌CKs和MMPs的过程中发挥重要作用。
　　3.SDS-PAGE鉴定结果显示，RA组存在若干OA组中没有的条带，其中可能含有瓜氨酸化的蛋白及可与鼠抗PADI4抗体结合的抗原成分。
　　4.通过检测RA及OA患者ST PADI4的表达水平，发现RA患者ST的PADI4的表达水平明显高于OA患者，但其表达水平的高低可能与患者血清中抗CCP、RF、CRP和ASO水平并不存在相关关系。

目录

摘要

第一章 前言

第二章 RA患者关节液IC对FLS增殖和分泌细胞因子功能的影响

第一节 研究目的

第二节 实验材料

2．1 研究对象

2．2 主要试剂及耗材

2．3 实验试剂配制

2．4 主要实验仪器

第三节 实验步骤

3．1 G蛋白免疫亲合层析法纯化SF-IC

3．2 BCA法蛋白定量

3．3 SF中抗CCP抗体水平检测

3．4 RA患者FLSs的分离与培养

3．5 FLSs的传代培养

3．6 FLSs的冻存和复苏

3．7 细胞增殖水平测定(CCK-8法)

3．8 ICs刺激对FLSs细胞分泌IL-6、IL-8、GM-CSF、MMP-3的作用

3．9 IL-6 ELISA法

3．10 IL-8 ELISA法

3．11 GM-CSF ELISA法

3．12 MMP-3 ELISA法检测

3．13 统计学分析

第四节 实验结果

4．1 抗CCP抗体检测结果

4．2 FLSs细胞原代培养

4．3 SF-IC刺激对RA FLSs增殖的影响

4．4 SF-IC刺激对RA FLSs分泌IL-6功能的影响

4．5 SF-IC刺激对RA FLSs分泌IL-8功能的影响

4．6 SF-IC刺激对RA FLSs分泌GM-CSF功能的影响

4．7 SF-IC刺激对RA FLSs分泌MMP-3功能的影响

第五节 讨论

第三章 PAD4在类风湿关节炎患者滑膜组织中的表达

第一节 研究目的

第二节 实验材料

2．1 标本来源

2．2 主要试剂

2．3 溶液配制

2．4 主要仪器

第三节 实验步骤

3．1 滑膜组织蛋白提取

3．2 蛋白定量

3．3 SDS—PAGE电泳

3．4 考马斯亮蓝染色

3．5 western blot

3．6 血清ACPA、ASO、CRP和RF测定

3．7 DAS28评分

3．8 统计学分析

第四节 实验结果

4．1 滑膜组织提取蛋白鉴定

4．2 RA、OA患者ST PAD4检测结果

4．3 RA患者ST PAD4相对表达量与相关临床指标的相关性

第五节 讨论

参考文献

综述 类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(FLS)的研究进展

成果

致谢

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