弓形虫RNA结合蛋白Puf2的克隆表达、亚细胞定位及功能初探

摘要

背景:
　　刚地弓形虫是一种专性细胞内寄生的单细胞原虫，寄生于除红细胞外的几乎所有有核细胞内，可侵犯脑、淋巴结、眼、肝、心、肺、肌肉等组织器官，从而引起人兽共患的寄生虫病，如弓形虫脑炎，弓形虫眼病等。在宿主免疫功能正常的情况下，入侵的弓形虫速殖子通常转化为感染能力较弱的缓殖子，形成包囊，寄生在宿主的脑、肌肉和视网膜等细胞中，使宿主处于隐性感染状态;当宿主患有艾滋病，恶性肿瘤等免疫功能受损或低下时，宿主体内的包囊中的缓殖子能活化转变为速殖子，迅速增殖，引起组织破坏，形成局部炎症，如不及时治疗，可导致宿主的死亡。因此速缓殖子之间的相互转换是刚地弓形虫致病的中心环节。而弓形虫急、慢性感染的生物学基础及机制，不论是物理学或生物学上的原因，其本质上都是在转录、转录后加工、翻译或者翻译后的修饰水平上发生的改变，导致了不同蛋白的期特异性表达。在生物体内正确的基因表达需要正确的时间，合适的数量以及在细胞内正确的位置等各个方面的集体作用，而如此紧密的调控不仅需要转录调控，同时也需要多层次的转录后控制。与转录调控相比，基因表达的翻译调控可以使细胞更迅速地对外部刺激作出响应。如近年研究火热的一类RNA结合蛋白-Puf蛋白，其中多项研究表明，从酵母到人类，Puf蛋白与靶RNA进行特异性结合，诱导其发生降解或者是抑制其降解从而使生物体内发生相应的变化。Puf蛋白是以黑腹果蝇的Pumilio（Pum）蛋白及秀丽隐杆线虫的Fem-3结合因子蛋白(FBF)进行命名的RNA结合蛋白，通过结合靶mRNA3’端非转录区(3'UTR)的特定核苷酸序列，通常称为Puf-结合序列(Puf binding element，PBE)来行使翻译调控。Puf蛋白的显著特征是具有一个高度保守的核心RNA结合结构域，简称为Puf域(Puf domain)，通常由8个连续的相似的Puf-RNA结构域，每个结构域包含36～40个氨基酸，形成3个α-螺旋结构，第一个和第八个结构域两端分别连接着一个不完全的结构域。据多项研究表明，在布鲁氏锥虫这种原虫中，Puf家族蛋白中的Puf1蛋白是影响虫体活力的一个必不可少的因素，其中Puf蛋白可以调控多种真核细胞的多种过程，如干细胞的维持，细胞器的生物合成，卵子的发生，神经元功能和记忆的形成过程等。值得注意的是，Muller等在疟原虫Puf2基因的研究中，敲除恶性疟原虫和伯氏疟原虫的Puf2基因后可促进配子体分化并提高雄/雌配子体比例，而伯氏疟原虫的Puf2基因敲除后，存在于蚊子唾液腺内的子孢子提早转化成类似于肝内早期阶段的形态。上述研究揭示了Puf2蛋白在顶复门原虫中起到调节mRNA翻译的一个分子作用机制。
　　同样为顶复门原虫的刚地弓形虫中，是否存在Puf2蛋白及其在刚地弓形虫速缓殖子转化的过程中是否发挥了一定的作用？本文从分子生物学水平来对TgPuf2蛋白进行特征分析，并探讨其在弓形虫速缓殖子中的表达情况，细胞定位，及对其的RNA结合能力进行初探。
　　目的:
　　1、检测在RH株刚地弓形虫中是否存在Puf2;
　　2、观察Puf2蛋白在RH株刚地弓形虫速缓殖子的表达情况;
　　3、观察Puf2蛋白在RH株刚地弓形虫速殖子的亚细胞定位情况;
　　4、TgPuf2RNA结合功能初探。
　　方法:
　　1、为了检测在RH株刚地弓形虫中是否存在Puf2，根据Toxo DB数据库中GT1株刚地弓形虫Puf2虫株基因序列(TGGT1_122890)设计特异性引物P1，以RH株cDNA为模板进行扩增。
　　2、通过碱性培养基(pH8.2)诱导形成缓殖子，采用RT-qPCR方法检测TgPuf2在速殖子和缓殖子两个时期的mRNA水平差异。
　　3、采用同源重组的方法在内源性TgPuf2蛋白的C端融合表达3×HA标签，构建TgPuf2-HA的转基因弓形虫虫株。以RH虫株的基因组DNA为模板扩增Puf23'末端约1.5 kb的同源序列，特异性引物为P2扩增产物插入pLIC-HAx3-DHFRTs内源性标记载体，使TgPuf2编码序列与标签蛋白的编码区可融合表达。
　　pLIC-Puf2HAx3-DHFRTs质粒通过测序鉴定正确无误后转染
　　RHΔKu80ΔHXGPRT虫株，在HFF宿主细胞生长24小时后，用1.0μM乙胺嘧啶进行药物筛选。待抗药虫子长起来后传代两次，然后用有限制稀释法筛选单克隆虫株，最后通过Western Blot和免疫荧光实验(Immunofluorescence assay，IFA)进行验证。
　　4、以RH株的cDNA为模版，用特异性引物P3扩增TgPuf2的Puf2结构域插入pET32a表达质粒的BamHⅠ和HindⅢ多克隆位点之间。TgPuf2的Puf结构域的C端融合表达组氨酸(His)，IPTG诱导表达后的菌体蛋白用抗His的抗体进行WesternBlot验证。通过亲和纯化获得His融合表达的重组蛋白——rTgPuf2-His。
　　5、采用电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）实验检测构建的重组蛋白rTgPuf2-His中Puf结构域的RNA结合活性。
　　6、培养构建的C2号TgPuf2-HA转基因虫株，收集虫体后进行免疫共沉淀(Immunoprecipitation，IP)实验，获得沉淀后进行总RNA的提取后送质谱分析，检测与Puf2相结合的RNA种类。
　　结果:
　　1、采用RT-PCR实验，证明在RH株刚地弓形虫中有Puf2基因。
　　2、比较TgPuf2在速殖子期和缓殖子期mRNA水平，RT-qPCR结果显示TgPuf2在mRNA水平缓殖子期低于速殖子期。
　　3、通过免疫荧光实验(IFA)和Western blot鉴定，成功构建了TgPuf2-HA的转基因弓形虫虫株。挑选两个单克隆虫株C1、C2作为后续蛋白表达的分析。用抗HA抗体通过Western blot检测显示一条大约206kDa大小的条带，与预测TgPuf2融合HA×3标签表达蛋白分子量大小相符，其母本虫株RHΔKu80未见反应条带。
　　4、用抗HA抗体通过IFA实验观察，发现TgPuf2主要定位于虫体胞浆中。
　　5、重组蛋白rTgPuf2-His纯化效果较佳，可用于后续实验。
　　结论:
　　TgPuf2在速殖子期和缓殖子期mRNA水平不同，提示TgPuf2可能在协助虫体适应宿主环境变化时调节细胞增殖和/或分化过程中发挥重要功能。这项研究为进一步阐明TgPuf2在弓形虫生长发育过程中的作用踏出了第一步。

目录

摘要

前言

第一章 实验材料

1．虫株及细胞系

2．主要试剂

3．主要耗材

4．主要仪器

第二章 实验方法

1．实验细胞及实验虫株培养

1．1 HFFs细胞培养

1．2 RH株、RH△Ku80△HXGPRT株弓形虫培养

2．Puf在RH株弓形虫mRNA水平验证及速缓殖子间差异

2．1 弓形虫总RNA的提取

2．2 RT-PCR实验

2．3 PCR产物回收并进行测序验证

2．4 弓形虫RH株缓殖子诱导实验

2．5 RT-qPCR实验

3．TgPuf2-HA转基因虫株构建及其亚细胞定位

3．1 不依赖于连接反应克隆(LIC)实验

3．2 质粒中提

3．3 转染实验

3．4 单克隆挑选

3．5 Western Blot实验

3．6 免疫荧光实验

4．TgPuf2RNA结合功能探索-一

4．1 Puf2结构域RT-PCR扩增，回收并验证

4．2 融合表达蛋白

4．3 IPTG诱导蛋白表达并验证

4．4 重组蛋白rTgPuf2-His纯化收集

4．5 体外RNA结合实验

5．TgPuf2RNA结合功能探索-二

5．1 收集TgPuf2-HA转基因虫株

5．2 免疫共沉淀实验

第三章 实验结果

1．实验虫株急性感染细胞模型建立

2．弓形虫RH株存在Puf2基因及其在速缓殖子间差异表达

3．TgPuf2-HA转基因弓形虫虫株的构建及其亚细胞定位

4．重组蛋白rTgPuf2-His纯化收集

第四章 结论与讨论

参考文献

硕士期间发表论文情况

附录

致谢

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