烟草小GTP结合蛋白NtRab5b的亚细胞定位及其功能分析

摘要

烟草(Nicotiana tobacum)NtRab5b是一个植物特异性的小GTP结合蛋白，本论文对其亚细胞定位及其功能进行了研究。首先，本研究在原核中表达了NtRab5的GST融合蛋白GST-NtRab5b。通过对GST-NtRab5b的测定证实了NtRab5b的GTP结合活性。为了进一步的定位和功能研究，本研究利用去除GST标签的重组NtRab5b作为抗原制备了NtRab5b特异性的抗体。
　　 接着对NtRab5b在细胞中的定位及第二位甘氨酸在定位中的作用进行了分析研究。因为预测其氨基端对定位有重要作用，所以将NtRab5b的羧基端与报告基因GFP融合构建了NtRab5b-GFP植物表达载体，并转化了烟草BY-2细胞。NtRab5b-GFP在转基因细胞中大部分呈点状结构。利用药物(wortmannin和brefeldin A)处理，根据NtRab5b-GFP标记结构的变化初步判断NtRab5b-GFP主要定位在前液泡区(prevacuolar compartment，PVC)。又进一步通过与前液泡区标记物VSRat-1共定位实验及免疫电镜实验证实了NtRab5b的前液泡区定位。与这些结果一致的是，瞬时共表达实验中NtRab5b-GFP还与也被定位在前液泡区的拟南芥同源蛋白Ara6和Rhal共定位；NtRab5b-GFP也与内吞示踪染料FM4-64共定位。点突变体NtRab5b(G2A)-GFP弥散分布于细胞质和细胞核中，NtRab5b氨基端40个氨基酸与GFP的融合蛋白NtRab5bN-GFP大部分定位在细胞膜上，因此证明了NtRab5b氨基端的第二位甘氨酸是其正确定位于前液泡区的必要而非充分条件。
　　 然后对NtRab5b在植物中的表达模式及转基因植物的表型进行了分析。Western blot分析表明NtRab5b在所检测的组织的根、茎、叶中普遍表达，没有组织特异性；幼苗和成熟植株中的表达也没有差异。有趣的是，盐胁迫早期时NtRab5b的RNA和蛋白表达水平都表现为上调。通过分析盐胁迫下NtRab5b、NtRab5b(G2A)超量表达和NtRab5b沉默的转基因烟草的表型，发现NtRab5b超量表达烟草的主根比野生型的长，而NtRab5b(G2A)超量表达烟草的主根比野生型的短，这表明NtRab5b可能通过前液泡区介导的内吞途径参与烟草幼苗对盐胁迫的反应。
　　 水稻OsRab5b是本实验室克隆的另一个植物特异性的Rab5b类。为了比较不同植物的Rab5b的定位，本论文也研究了OsRab5b在细胞中的定位及第二位甘氨酸在定位中的作用进行了分析研究，其思路和结果都和NtRab5b的相似。NtRab5b-GFP在转基因细胞中大部分呈点状结构。利用药物(wortmannin和brefeldin A)处理，根据OsRab5b-GFP标记结构的变化初步判断NtRab5b-GFP主要定位在前液泡区(prevacuolar compartment，PVC)。又进一步通过与前液泡区标记物VSRat-1共定位实验证实了OsRab5b的前液泡区定位。与这个结果一致的是，OsRab5b-GFP也与内吞示踪染料FM4-64共定位。点突变体OsRab5b(G2A)-GFP弥散分布于细胞质和细胞核中，因此证明了OsRab5b氨基端的第二位甘氨酸是其正确定位所必需的。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:图表目录、缩略词表

声明

第1章 前言

1.1 文献综述

1.1.1 GTP结合蛋白

1.1.2 小GTP结合蛋白

1.1.3 Rab家族蛋白

1.1.4 Rab5亚家族蛋白

1.1.5 晚期内吞体(Late endosome)、前液泡区(PVC)和多泡体(MVB)

1.1.6 Rab蛋白和植物发育及环境(胁迫)的关系

1.2 研究目的

第2章 烟草NtRab5b 5'RACE及NtRab5b蛋白序列分析

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 材料

2.2.2 仪器及设备

2.2.3 试剂及其配制

2.2.4 方法

2.3 结果

2.3.1 NtRab5b的5'RACE及5'UTR序列

2.3.2 NtRab5b cDNA全长序列的PCR扩增及序列分析

2.3.3 NtRab5b蛋白序列的分析

2.4 讨论

第3章 烟草NtRab5b在大肠杆菌中的表达、活性分析及NtRab5b多克隆抗体的制备

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 材料

3.2.2 仪器及设备

3.2.3 试剂及其配制

3.2.4 方法

3.3 结果

3.4 讨论

第4章 NtRab5b在烟草BY-2细胞中的定位

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 材料

4.2.2 仪器设备

4.2.3 试剂及其配制

4.2.4 方法

4.3 结果

4.3.1 NtRab5b氨基端(NtRab5bN)与GFP融合表达载体pJL11的构建

4.3.2 转基因细胞的获得和鉴定

4.3.3 转基因细胞对wortmannion和BFA处理的反应

4.3.4 NtRab5b与前液泡标记物VSR的共定位

4.3.5 NtRab5b在BY-2细胞超薄切片中的定位

4.3.6 NtRab5b和内吞示踪染料FM4-64的共定位

4.3.7 NtRab5bN-GFP、NtRab5b-GFP、NtRab5b(G2A)-GFP瞬时表达载体pJL16、pJL20、pJL21的构建

4.3.8 NtRab5b与拟南芥同源蛋白的共定位

4.4 讨论

第5章 NtRab5b在烟草中的表达及转基因烟草的表型分析

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 材料

5.2.2 仪器设备

5.2.3 试剂及其配制

5.2.4 方法

5.3 结果

5.3.1 NtRab5b在烟草中不同发育阶段、不同组织的表达分析

5.3.2 NtRab5b在盐胁迫时的表达分析

5.3.3 NtRab5b和NtRab5b(G2A)超量表达烟草植株的获得与northern blot、PCR鉴定

5.3.4 NtRab5b沉默载体pJL10的构建

5.3.5 NtRab5b沉默烟草的获得及PCR鉴定

5.3.6 NtRab5b、NtRab5b(G2A)超量表达和NtRab5b沉默烟草的western blot鉴定

5.3.7 转基因烟草的盐胁迫分析

5.3.8 转基因烟草的蒸腾分析

5.3.9 NtRab5b和NtRab5b(G2A)转基因烟草中NtRab5b和NtRab5b(G2A)RNA量的分析

5.3.10 NtRab5b和NtRab5b(G2A)体外稳定性分析

5.4 讨论

5.4.1 前液泡区定位的NtRab5b与盐胁迫

5.4.2 NtRab5b可能以一种不同于VPS9a依赖的途径调节根的生长

5.4.3 NtRab5b超量表达不影响植物的蒸腾作用

5.4.4 NtRab5b的表达可能受豆蔻酰化途径的调节

第6章 水稻小GTP结合蛋白OsRab5b在烟草BY-2细胞中的定位

6.1 前言

6.2 材料与方法

6.3 结果

6.3.1 转基因细胞对wortmannion和BFA处理的反应

6.3.2 OsRab5b与前液泡区标记物VSR的共定位

6.3.3 OsRab5b与内吞体标记物FM4-64的共定位

6.4 讨论

第7章 超量表达水稻小GTP结合蛋白OsRab5a的转基因烟草的获得与鉴定

7.1 前言

7.2 材料和方法

7.2.1 材料

7.2.2 方法

7.3 结果

7.3.1 pG-5AE(GST-OsRab5a)的鉴定

7.3.2 OsRab5a植物超量表达载体的构建

7.3.3 GFP-OsRab5a植物超量表达载体的构建

7.3.4 OsRab5a超量表达烟草的建立和鉴定

7.3.5 GFP-OsRab5a超量表达烟草的建立和鉴定

7.4 讨论

第8章 结论与展望

参考文献

附录

致谢