以斑马鱼为动物模型探讨臭氧对于组织损伤后再生的作用及其机制

摘要

目的：
　　以斑马鱼为动物模型探讨臭氧对于组织损伤后再生的作用及其机制。
　　方法：
　　斑马鱼模型建立:
　　实验所需的野生型AB-wide及Tg(mpo:GFP)[19]型斑马鱼均由广东省人类疾病及药物斑马鱼模型重点实验室提供。斑马鱼根据Westerfield提供的标准饲养方式饲养[20]。所有器材在使用之前均需高压消毒[21，22]。
　　臭氧水配制:
　　臭氧是一种极不稳定的强氧化气体，较氧气易溶于水[23，24]。臭氧水的制各直接由臭氧气体持续注入水中五分钟所得（高氧液体制备仪，前沿医学）。水中离子影响臭氧稳定性加速臭氧降解，但纯净的dd H2O对于幼鱼生长及生存影响较大，仍选择含有离子的系统水为臭氧水的配制用水。
　　实验用臭氧水浓度测定:
　　臭氧水浓度测定:将新鲜配制的臭氧水与系统水按照1∶0、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的比例配制成臭氧水工作液，用臭氧水浓度测定试剂盒（DPD臭氧测定试剂盒，陆恒生物）半定量各比例臭氧水浓度。
　　实验用臭氧水安全浓度测定:
　　不同浓度臭氧水中72hpfAB-wide幼鱼生存曲线:将72hpfAB-wide幼鱼分为六个组，分别给予浓度为上述比例配制好的臭氧水处理，体式显微镜下于处理后每五分钟记录各组幼鱼死亡数量，记录1h。
　　吖啶橙（细胞凋亡）染色:将72hpfAB-wide幼鱼分为六个组，分别给予浓度为上述比例配制好的臭氧水处理10分钟后，分别孵育在1ml浓度为5ug/mL的吖啶橙中染色半小时，再用PBST清洗三次后置于载玻片上应用荧光显微镜观察幼鱼全身细胞凋亡情况[25]。
　　观察比较尾鳍生长:
　　72hpfAB-wide型幼鱼，在体视显微镜下用1ml注射器针头沿体节末端垂直体长轴切除幼鱼尾鳍[26]，随机分为a、b、c三组，分别给予系统水、单次臭氧水（仅给予一次臭氧水）及多次臭氧水（每12h更换新鲜臭氧水）处理，监测水中臭氧浓度变化。于尾鳍切除后0h、24h、48h、72h、120h(hpa)，在显微镜下测量a、b、c三组幼鱼尾鳍生长长度并进行比较。
　　尾鳍切除后中性粒细胞迁移:
　　72hpf Tg(mpo:GFP)幼鱼，按上述方式切除幼鱼尾鳍，随机分为两组，分别给予系统水及臭氧水处理。于0.5、1、2、3hpa在共聚焦显微镜下观察记录迁移到尾鳍切口的中性粒细胞数量[19]。
　　荧光定量RT-PCR:
　　72hpfAB-wide幼鱼，按上述方式切除幼鱼尾鳍，随机分为两组，分别给予系统水及多次臭氧水处理。于0、6、12、24、48、72hpa留取标本[21]，应用trizol(Takara)法提取样本RNA，应用逆转录试剂盒(Takara)逆转录得到总cDNA。应用逆转录产物cDNA进行Q-PCR，测定目的基因的表达。Q-PCR仪采用LightCycler Nano(Roche)及Sybr Green荧光染料(Takara)。
　　Immunoblotting:72hpfAB-wide幼鱼，按上述方式切除幼鱼尾鳍，随机分为两组，分别给予系统水及多次臭氧水处理。于0、6、12、24、48、72hpa留取标本，提取蛋白后应用Western Blot检测TNF-α表达量。
　　统计方法:
　　所有数据均应用SPSS19.0进行处理。尾鳍生长长度比较应用协方差分析，尾鳍中性粒细胞计数及Q-pcr结果统计应用两独立样本的t检验。P≤0.05可认为两组数据差异具有统计学意义。
　　结果:
　　臭氧水安全实验浓度:
　　确定制备臭氧水的基础用水:臭氧水极不稳定，自身可以降解[27，28]，且水中离子成分、液体温度、液体PH值都可影响其降解速度，因此在实验之前首先就要确定配制臭氧水的基础用水。首先，比较dd H2O与系统水饲养环境下幼鱼生存率，结果可见dd H2O幼鱼生存率明显低于系统水组，应选用系统水作为配制臭氧水的基础用水。一般饲养幼鱼的系统水中都会加入亚甲蓝抑菌，但臭氧可与亚甲蓝反应，产物未知，所以实验用的幼鱼都不可接触亚甲蓝。
　　臭氧水实验安全浓度测定
　　臭氧水浓度测定:当臭氧水与系统水以1∶0、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4混合后测得相应的浓度分别为1.5、1.0、0.5、0.2、0.1、0.05mg/L。
　　不同浓度臭氧水中幼鱼生存时间不同:当臭氧水浓度大于0.2mg/L时，幼鱼生存时间随浓度降低而增加;当臭氧水浓度≤0.2mg/L时，幼鱼生存时间不受臭氧水浓度影响，且每12小时更换新鲜臭氧水不会对幼鱼造成累加性损伤，生存率无差别。
　　细胞损伤凋亡:臭氧为强氧化剂，溶于水后会造成斑马鱼幼鱼全身组织器官的损伤。不同浓度臭氧水对于斑马鱼幼鱼损伤不同。结果见臭氧水浓度越高，斑马鱼幼鱼全身损伤越严重。该结果提示，当臭氧水浓度为前一结果测得的安全浓度0.2mg/L时，臭氧水对于幼鱼循环系统及尾鳍有轻微损伤，对其生存无影响。当臭氧水浓度低于0.1 mg/L，对斑马鱼幼鱼无损伤。由以上实验结果可确定0.1mg/L为实验用臭氧水浓度。
　　尾鳍生长长度比较
　　在显微镜下观察记录a，b，c三组幼鱼尾鳍切除后生长情况。尾鳍切除后24小时之内，a组未出现明显再生修复，bc两组再生修复已开始;尾鳍切除后48h内，bc两组尾鳍生长长度均大于a组;尾鳍切除后72小时，c组尾鳍已基本完成轮廓及鳍条再生，而ab两组尾鳍在切除后120h才完成再生。
　　在有标尺的显微镜下测量记录abc三组幼鱼切除尾鳍后尾鳍生长长度。ab两组各时间点尾鳍生长长度比较:0、24、72hpa两组幼鱼尾鳍长度无差别，48hpa两组幼鱼尾鳍长度有差别(p＜0.01)。即ab两组幼鱼48hpa尾鳍生长长度有差别，差别在72小时时消失。ac两组各时间点尾鳍生长长度比较:0hpa两组幼鱼尾鳍长度无差别，24、48、72hpa两组幼鱼尾鳍长度有差别，相同时间点a组尾鳍长度较c组短(p＜0.0001)。即ac两组幼鱼从尾鳍切除后24小时开始，尾鳍生长长度一直有差别(P＜0.0001)，差别持续到72小时以后。
　　监测臭氧水浓度:可见单次给药组臭氧浓度随时间推移逐渐降低，至48hpa浓度降为0mg/ml。多次给药组臭氧浓度也随时问逐渐降低，但由于每12h更换一次，药物浓度始终不为0mg/ml。
　　72hpf MPO-GFP尾鳍切除后中性粒细胞迁移:
　　共聚焦显微镜拍摄:72hpf MPO-GFP尾鳍切除后0.5、1、2、3小时时中性粒细胞迁移至尾鳍创面伤口。结果可见，在0.5、2、3hpa，尾鳍切除后创口处中心粒细胞数实验组较对照组多(p＜0.01)，1hpa尾鳍切除后创口处中心粒细胞数实验组较对照组多，但差别较其他时间点小(p＜0.05)。
　　肿瘤坏死因子(TNF-α)表达
　　肿瘤坏死因子作为炎症反应中的主要因子，一直被人们关注研究。臭氧相关动物实验研究证实，臭氧可以抑制肿瘤坏死因子的表达。而我们的结果证实臭氧并非单纯抑制肿瘤坏死因子的表达。24hpa以内为尾鳍切除后炎症期，TNF-α作为炎症因予，臭氧促进其表达。24hpa以后为炎症消退后的组织再生期，组织再生程序启动，TNF-α主要作用表现为抑制再生，臭氧抑制其表达。臭氧通过双向调控TNF-α表达促进组织再生。
　　臭氧对于TNF-α的调控机制
　　选取TNF-α上游基因IL-10、STAT3，以及受上述两个基因调控的IL-1β作为目的基因。结果可见，STAT3在12hpa以后受IL-10调控，其表达趋势与IL-10相同。IL-1β表达趋势与其他文献相同，并且与本实验结果中的TNF-α表达趋势基本一致;受STAT3调控，但该调控具有明显的双相性，即该通路调控与再生时间段有关，24hpa为基本时间分界线。
　　结论：
　　1.我们通过测定不同浓度臭氧水对于72hpf幼鱼的机体损伤及生存影响，摸索出实验用臭氧水的安全浓度为0.1mg/L。该浓度既保证了实验结果的准确性，又保证了臭氧效果最大化。
　　2.利用上述模型，我们证实了臭氧水对于斑马鱼尾鳍再生具有促进作用，且该作用在停止给药后逐渐消失。即对照组、单次给药组和多次给药组三组幼鱼尾鳍生长速度差别是由于臭氧作用时间长短不同引起的。
　　3.臭氧在创伤修复早期促进创面中性粒细胞迁移，加速尾鳍坏死细胞清除，促进组织再生。本实验推翻了之前臭氧抑制组织炎症的结论，论证了在组织损伤后再生早期，臭氧促进了组织炎症。
　　4.臭氧对于TNF-α的调节为双向调节，该调节完全依从于组织再生的需要。本实验推翻了前人研究的臭氧抑制TNF-α的结论，验证了臭氧在组织损伤后再生早期促进TNF-α的表达，而在再生后期抑制TNF-α的表达。
　　5.尝试性的探索了臭氧对于TNF-α的调控机制，论证了臭氧在组织损伤后再生后期通过调控IL-10的表达从而调控TNF-α，但该调控并不是唯一调控通路。

目录

摘要

前言

第一章 斑马鱼臭氧模型的建立

1．1 研究内容

1．2 观察指标

1．3 实验方法

1．3．1 斑马鱼的饲育

1．3．2 臭氧水配制

1．3．3 臭氧水浓度测定

1．3．4 实验用臭氧水安全浓度测定

1．4 统计学处理

1．5 结果

1．5．1 臭氧水安全实验浓度

1．5．2 臭氧水实验安全浓度测定

1．5．3 细胞损伤凋亡

1．6 讨论

1．7 结论

第二章 臭氧对斑马鱼尾鳍切除后再生的影响

2．1 研究内容

2．2 观察指标

2．3 实验方法

2．3．1 形态学观察比较尾鳍生长

2．4 统计学处理

2．5 结果

2．5．1 尾鳍生长长度比较

2．6 讨论

2．7 结论

第三章 臭氧通过调节TNF-α的表达促进尾鳍再生

3．1 研究内容

3．2 观察指标

3．3 实验方法

3．3．1 中性粒细胞迁移

3．3．2 TNF-α基因定量检测

3．4 统计学处理

3．5 结果

3．5．1 72hpf MPO-GFP尾鳍切除后中性粒细胞迁移

3．5．2 肿瘤坏死因子(TNF-α)表达

3．5．3 臭氧对于TNF-α的调控机制

3．6 讨论

3．7 结论

全文小结

参考文献

英文缩写词表

附录

成果

致谢

声明