精子形态选择性胞浆内单精子注射对辅助生育结局的影响及其作用机制的相关研究

摘要

目的：
　　1、使用活精子细胞器形态学检测(MSOME)系统系统对不育男性患者的精子进行形态选择性卵母细胞浆内单精子注射术(IMSI)，观察IMSI技术能否改善因男性精液问题而不孕不育夫妇的助孕结局。
　　2、使用活精子细胞器形态学检测(MSOME)系统对不育患者的精液样本进行形态学分析，定义新的MSOME系统参数，分析这些MSOME参数与传统常规精液参数及卵母细胞浆内单精子注射(ICSI)周期助孕结局之间的关系，最终确立一个最有意义的MSOME参数并探讨其对不育患者的诊断价值及ICSI周期助孕结局的预测价值。
　　3、通过MALBAC单细胞全基因组扩增技术结合二代测序的方法(CNV-Seq)对活精子细胞器形态学检测(MSOME)系统下挑选的不同形态的单个精子进行染色体核型的分析，探讨MSOME系统下观察到的精子形态异常与染色体核型异常的相关性从而发掘MSOME系统该善ICSI患者助孕结局的相关机制。
　　方法：
　　1、回顾分析四川省成都市锦江区妇幼保健院生殖医学中心2013年1月至2014年11月共82例梗阻性无精子症患者，将行TESA（经皮睾丸穿刺抽吸精子术）获得的睾丸精子通过放大系统(×6600)挑选后行卵母细胞注射(IMSI组)，2013年1月至2014年11月共91例梗阻性无精子症患者经TESA取精术后行常规卵母细胞浆内单精子注射（ICSI组）;2014年1月至11月共44例畸精子症患者行形态选择性包浆内单精子注射治疗（IMSI组），2014年1月至11月共71例畸精子症患者行常规ICSI治疗（ICSI组）。统计分析ICSI组和IMSI组患者的实验室结局和临床结局。
　　2、选取50例在四川省成都市锦江区妇幼保健院生殖医学中心进行ICSI治疗的少、弱、畸精子症患者，将每位患者的精液样本分成两份，一份进行常规精液分析;另一份精液样本经过预处理后首先在常规ICSI周期低倍镜下(×400)挑选出形态正常的活精子30个，随后使用MSOME放大系统，在高倍镜(×6600)下对经过低倍镜挑选出的活精子进行细胞器形态学检测分析，并统计相关MSOME参数（二次挑选后的MSOME正常形态精子率、MSOME头部大空泡精子率），将MSOME参数与常规精液参数、男方年龄、受精率、优质胚胎率、囊胚形成率进行相关分析。将MSOME参数、女方年龄、不孕年限、男方常规精液参数等对助孕结局的影响采用Logistic回归分析，并用受试者工作曲线(ROC)对回归模型进行分析。若Logistic回归方程提示存在MSOME参数对妊娠结局的影响有统计学意义，则运用受试者工作曲线(ROC)分析该MSOME参数对ICSI周期助孕结局的预测价值，并最终确定一个MSOME参数临界值用来预测ICSI周期患者的助孕结局。
　　3、选取3例于2015年5月-2015年12月在四川省成都市锦江区妇幼保健院生殖医学中心进行ICSI治疗的重度少弱畸精子症患者，于取卵日当天嘱患者手淫方式排精，将每位患者的精液样本分成两份，一份进行常规精液分析;另一份精液样本经过预处理后在MSOEM放大系统(×6600)下进行观察挑选，每份样本中挑选10条形态正常的活动精子以及20条头部存在大空泡（空泡面积＞4％头部面积）的活动精子。接着对每条精子进行单精子全基因组扩增(WGA)在平均＞0.02×深度下进行全基因组拷贝数变异分析CNV-Seq，从而发现非整倍体、染色体大片段增加或缺失、非平衡易位等染色体核型异常。
　　结果：
　　1、梗阻性无精子症患者中正常受精率IMSI组显著高于ICSI组(84.3％ vs77.0％)(P＜0.05);ICSI组的卵裂率95.5％，优胚率28.2％，囊胚形成率54.8％，种植率26.4％，临床妊娠率47.3％，流产率14％，梗阻性无精子症IMSI组患者的卵裂率96.7％，优胚率29.2％，囊胚形成率54.3％，种植率32.3％，临床妊娠率50.0％，流产率7.3％，两组无显著性差异(P＞0.05)。畸精子症患者的正常受精率IMSI组显著高于ICSI组(68％vs75.5％)(P＜0.05)，囊胚形成率IMSI组显著高于ICSI组(54.6％ vs67.9％)(P＜0.05)，ICSI组的卵裂率96.2％，优胚率27.6％，种植率28.2％，临床妊娠率43.7％，流产率9.7％; IMSI组患者的卵裂率95.2％，优胚率27.1％，种植率30.7％，临床妊娠率43.2％，流产率10.5％，两组无显著性差异(P＞0.05)。
　　2、两个MSOEM参数均与常规精液参数中的正常精子百分比及囊胚形成率存在相关性(p＜0.05)。二次挑选后的MSOME正常形态精子率与正常精子百分比、囊胚形成率呈正相关(R=0.670，P=0.000; R=0.513，P=0.000)，与其他常规精液参数、ICSI周期的受精率、卵裂率、D3优胚率、囊胚形成率无相关性(p＞0.05);二次挑选后MSOME头部大空泡精子率与正常精子百分比、囊胚形成率呈负相关（R=-0.566，P=0.000; R=-0.356，P=0.003），与其他常规精液参数、ICSI周期的受精率、卵裂率、D3优胚率、囊胚形成率无相关性(p＞0.05)。二次挑选后MSOME头部大空泡精子率、a级精子比、a+b级精子比对生化妊娠的影响有统计学意义(p＜0.05);另一MSOME参数（二次挑选后的MSOME正常形态精子率）及其他因素对生化妊娠的影响无统计学意义(p＞0.05);多因素Logistic回归模型对生化妊娠结局有预测价值（ROC曲线下面积为0.890，敏感度为90.91％，特异性为84.6％）;MSOME参数（二次挑选后MSOME头部大空泡精子率）对生化妊娠结局有预测价值(ROC曲线下面积为0.828)，同时分析得到一个最佳临界值56.2％(敏感度为86.96％，特异性为69.23％)，将56.2％作为平均MSOME头部大空泡精子率的临界值，根据这一取值对50例纳入研究的患者进行分组（A组n=35、B组n=15），结果显示:A、B两组在卵裂率(98.0％vs91.5％)、生化妊娠率(61.8％ vs7.1％)、种植率(81.0％ vs0)上有显著性差异(p＜0.05);受精率、囊胚形成率、D3优胚率无显著性差异(p＞0.05)。
　　3、3名重度少弱畸精子症患者共36条单精子，其中24条含空泡精子中检测出染色体核型异常精子14条，多条常染色体缺失或增加精子12条，染色体大片段缺失或增加的精子1条，出现XX/XY/YY二体畸形的精子4条;12条形态正常精子中检测出染色体核型异常精子5条，其中多条常染色体缺失或增加精子5条，染色体大片段缺失或增加的精子0条，出现XX/XY/YY二体畸形的精子1条。
　　结论：
　　1、梗阻性无精子症患者的睾丸精子经放大系统选择后行ICSI，正常受精率较传统ICSI有显著性提高;畸精子症患者射出的精液标本经放大系统挑选后行ICSI，正常受精率、囊胚形成率较传统ICSI有显著性提高。
　　2、两个MSOME参数均与精子常规参数中的正常精子百分比具有相关性，而且都影响ICSI周期中的后期胚胎发育情况;二次挑选后MSOME头部大空泡精子率、a级精子比、a+b级精子这三项影响因素比对生化妊娠结局的影响有统计学意义;且MSOME参数综合其他相关影响因素对预测ICSI治疗周期的妊娠结局有一定的临床意义;在本研究中我们确立了一个MSOME参数（二次挑选后MSOME头部大空泡精子率）的临界值，同时证明了这一参数与ICSI妊娠结局的关系，这一MSOME参数（二次挑选后MSOME头部大空泡精子率）可作为独立因素用来预测ICSI治疗周期的妊娠结局。
　　3、本实验证实MSOME系统观察的头部含大空泡精子（＞4％头部体积）与正常形态精子的非整倍体发生率无显著性差异，但较后者有上升趋势，这可能是由于纳入本次实验的单精子数量有限导致。MSOME系统可降低挑选到染色体核型异常的精子，这可能是前期试验中证实的IMSI技术可提高畸精子症患者助孕结局的潜在机制。

目录

摘要

前言

第一部分 精子形态选择性卵胞浆内单精子注射对单纯男性因素不育患者的胚胎发育及临床结局的影响

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二部分 MSOME形态评估方法与传统精液参数及ICSI结局的关系

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第三部分 应用二代测序技术探究严重少弱畸精子症患者精子细微形态异常与染色体核型异常的相关性

前言

1 研究方法

2 结果

3 讨论

综述 MSOME及IMSI技术在辅助生殖领域中的应用进展

参考文献

攻读硕士学位期问发表论文

致谢

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