差异基因表达谱分析小鼠烧伤早期刺激反应相关基因靶标

摘要

本实验包括两个部分:
　　第一部分 小鼠烧伤早期刺激反应相关基因靶标的筛选
　　目的：
　　利用生物信息学方法对小鼠烧伤早期免疫细胞差异基因表达谱进行分析，以期对小鼠烧伤后免疫细胞应对刺激反应过程的机制加以了解，为筛选出烧伤早期应对刺激反应相关治疗靶标。
　　方法：
　　1.基因芯片数据筛选:从NCBI的GEO(Gene Expression Omnibus)数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）进行基因芯片样本筛选，样本需满足以下筛选条件:①烧伤动物模型，TBSA＞20％，Ⅲ度烧伤或烫伤;②烧伤或烫伤分组时间少于48小时:③样本及对照数目大于3。最终经过芯片质量评估，归类整理后发现，由Lederer JA等提交的GSE7404（动物模型为小鼠，25％TBSA，Ⅲ度烧伤）数据集满足以上筛选条件。我们从中选取烧伤后第1天组免疫细胞样本数据进行分析，总共有8个样本符合条件，其中4个为烧伤组，4个为对照组。本研究所需GSE7404数据是GPL1261平台Affymetrix Mouse Genome4302.0Array基因芯片，为全血游离白细胞基因芯片。
　　2.基因芯片数据的处理:由于基因芯片平台的差异、系统误差的存在和后期计算的需要，我们对基因芯片数据进行分析之前，需要先进行预处理(pre-procession)。预处理的过程主要包括:数据过滤，去除异常数据和噪音数据;补缺失值，保证数据的完整性;对数转换，以满足正态分布的分析要求;标准化，纠正系统误差，以发现真正的生物学变异。
　　3.功能富集分析:在本次研究中，我们应用GO-function数据包对基因进行功能注释，以有效的处理GO功能中的冗余，使分析结果更加可靠精确。应用DAVID数据库(Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery)对基因数据进行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因与基因组百科全书）是由日本京都大学和东京大学联合开发的数据库，KEGG通路富集分析是目前常被使用的芯片数据基因功能分析方法，它利用的数据是一些已经研究清楚的基因之间的相互作用，即就是生物通路。本研究通过DAVID数据库所筛选刺激反应相关差异基因，并选取刺激反应相关差异基因进行KEGG通路富集分析后，选取与烧伤后免疫细胞刺激反应相关通路。
　　4.刺激反应相关基因蛋白互作网络构建及分析:将选取的免疫系统相关差异基因应用DAVID进行基因ID转换，将转换的差异基因输入到STRING9.1数据库中，选取交互作用评分大于0.4（中等可信度）的互作关系构建刺激反应相关差异基因的蛋白互作网络（Protein-protein interaction network）。网络分析及MCL子网络聚类分析采用生物图表可视化工具Cytoscape软件进行。STRING数据库(http://string.embl.de)是一个搜寻已知蛋白质之间和预测蛋白质之间相互作用的系统，它不仅包括蛋白质与蛋白质之间直接的物理的相互作用，而且包括蛋白质与蛋白质之间间接功能的相关性。Cytoscape作为一个开源性网络分析和可视化数据分析软件，目前它可以将生物分子交互网络与高通量基因表达数据和其他的分子状态信息整合建构可视化的分子交互作用网络，并且对大规模蛋白质和蛋白质之间相互作用、蛋白质和DNA之间等交互作用的关联性进行分析。
　　结果：
　　1.基因芯片分析结果:在烧伤后第一天差异基因进行基因功能本体(GO)分析显示，共有259个刺激反应相关差异基因被选出，其中上调基因118个，下调基因141个。通过KEGG通路富集结果显示前10个通路符合阈值要求并被显著富集。主要为包括免疫系统相关通路（toll样受体信号通路;B细胞受体信号通路;T细胞受体信号通路等）;细胞过程中的细胞生长与死亡相关通路(p53信号通路;细胞凋亡通路);环境信息进程中的信号转导相关通路。其中差异基因富集最多、最显著的为toll样受体信号通路。
　　2.刺激反应相关蛋白互作网络分析:在刺激反应相关蛋白互作网络图中共由226个节点，1232条边组成，在蛋白互作网络中位于中心位置并且与其他蛋白或基因具有最大互作关系的蛋白或者基因在生物学过程中具有更重要的意义。在蛋白互作网络图中我们发现Jun(Stress=67)、Stat1(Stress=67)、Bcl2(Stress=56)、Stat3(Stress=54)、Tlr2(Stress=47)、Myd88(Stress=45)、Jak2(Stress=41)、Lck(Stress=40)、Hck(Stress=38)、Ptpn6(Stress=38)10个基因位于网络中心，具有最高互作关系。为了筛选出与刺激反应过程相关的重要的节点基因，我们通过MCL分析方法对原始蛋白互作网络进行聚类分析，选取力度系数大于4.0，互作关系大于6的网络模块进行下一步分析。我们发现MCL分析总共有7个子网络被选出。
　　结论：
　　通过对小鼠烧伤后一天全血游离白细胞基因芯片分析我们发现Lck、Stat1、Myd88、Stat3和Jun基因在烧伤早期应对刺激反应过程中可能发挥重要的作用，是潜在的生物靶标。
　　第二部分 运用荧光定量PCR技术验证靶标基因
　　目的：
　　通过动物学实验来验证小鼠烧伤后刺激反应相关重要靶标基因。
　　方法：
　　动物分组及烫伤模型建立:选取50只健康成年BALB/c小鼠，体重22-24g，雌雄不限，由南方医科大学动物实验中心提供，并清洁级饲养。分组:假烧伤（Sham）组10只，实验组40只，实验组按烫伤后时间分为烫伤后2h、6h、12h和24h组。模型建立:小鼠用1％的戊巴比妥钠(50m g/kg)腹腔麻醉后，将小鼠背部备皮，尽量不伤及皮肤，硫化钠去尽背部毛发，背部脱毛区域大小4*4cm（约25％TBSA），将小鼠固定于操作板上。将小鼠背部脱毛区域置于97℃热水中烫伤15秒（导致25％Ⅲ度烫伤创面），烫伤后立即腹腔注射0.9％无菌生理盐水1ml抗休克处理，创面使用碘伏消毒后，再无菌纱布包扎。根据时间点行眼部取血，并提取血液中的白细胞，最后用Real-time qPCR法检测小鼠烧伤后白细胞中Lck、Stat1、Myd88、Stat3和Jun mRNA的表达情况。
　　结果：
　　1.以MM-GAPDH为内参，我们使用荧光定量PCR技术检测了小鼠烫伤后2h、6h、12h、24h白细胞中Lck mRNA的相对表达量。以sham组为对照，小鼠烫伤后2h、6h、12h、24h白细胞中Lck mRNA相对表达量(x±s)如下:0.817±0.108、0.644±0.186、0.369±0.120、0.536±0.131，各组与对照组相比较，组间差异均有统计学意义(P＜0.05)。根据数据显示，小鼠烫伤后Lck mRNA的表达量在12h处于较低水平，在烫伤后24h内整体表达下降趋势。
　　2.以MM-GAPDH为内参，我们使用荧光定量PCR技术检测了小鼠烫伤后2h、6h、12h、24h白细胞中Stat-1 mRNA的相对表达量。以sham组为对照，小鼠烫伤后2h、6h、12h、24h白细胞中Stat-1 mRNA相对表达量(x±s)如下:0.780±0.127、0.527±0.136、0.338±0.157、0.219±0.110，各组与对照组相比较，组间差异均有统计学意义(P＜0.05)。根据数据显示，小鼠烫伤后Stat-1 mRNA的表达量在24h处于最低水平，在烫伤后24h内整体表达持续下降趋势。
　　3.以MM-GAPDH为内参，我们使用荧光定量PCR技术检测了小鼠烫伤后2h、6h、12h、24h白细胞中Myd88 mRNA的相对表达量。以sham组为对照，小鼠烫伤后2h、6h、12h、24h白细胞中Myd88 mRNA相对表达量(x±s)如下:1.498±0.114、1.399±0.082、1.433±0.160、1.434±0.200，各组与对照组相比较，组间差异均有统计学意义(P＜0.05)。根据数据显示，小鼠烫伤后Myd88 mRNA的表达量在2h表达量明显增加，在烫伤后24h内表现出持续高表达。
　　4.以MM-GAPDH为内参，我们使用荧光定量PCR技术检测了小鼠烫伤后2h、6h、12h、24h白细胞中Stat-3 mRNA的相对表达量。以sham组为对照，小鼠烫伤后2h、6h、12h、24h白细胞中Stat-3 mRNA相对表达量(x±s)如下:1.424±0.107、1.529±0.094、1.396±0.080、1.680±0.129，各组与对照组相比较，组间差异均有统计学意义(P＜0.05)。根据数据显示，小鼠烫伤后Stat-3 mRNA的表达量在12h处于较高水平，在烫伤后24h内整体表达上调。
　　结论：
　　通过动物实验发现小鼠白细胞中Lck、Stat1、Myd88、Stat3和Jun mRNA表达情况与基因芯片数据分析结果相一致，这进一步证实了这些差异表达基因在应对烧伤刺激反应过程中发挥了重要作用。

目录

摘要

第一章 序言

参考文献

第二章 小鼠烧伤早期刺激反应相关基因靶标的筛选

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

参考文献

第三章 运用荧光定量PCR技术验证靶标基因

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

参考文献

全文总结

攻读硕士学位期间成果

致谢

声明