差异基因表达谱分析并检测小鼠烧伤早期免疫相关基因靶标的表达

摘要

研究背景：
　　严重烧伤将引起机体免疫功能的紊乱，而后者则被认为是导致烧伤患者发生多种难以控制的并发症如多器官功能障碍综合征(MODS)、全身炎症反应综合症（SIRS）的重要因素之一。现阶段针对烧伤后免疫功能变化的研究多是对免疫细胞及免疫因子的作用机制入手，亦或者从感染是器官功能损害方面出发，并无对烧伤后基因转录水平变化进行深入的研究与分析。而对基因芯片数据的分析以及生物信息学技术的应用能帮助寻找出在烧伤早期潜在的诊断及治疗的靶标。
　　本课题组在前期选取并研究分析了GEO(Gene Expression Omnibus)数据库中小鼠烧伤后早期白细胞基因芯片的数据，发现烧伤后小鼠白细胞表现为多种生物学过程的紊乱，其中免疫系统过程、刺激反应等生物学过程贯穿整个烧伤早期，有研究显示Myd88、Stat3、Stat1、Jun等基因在烧伤早期刺激反应过程中起着重要的作用。为从分子水平了解烧伤后免疫相关基因的表达情况的变化，并筛选出在其中占据重要位置的差异基因靶标，本实验利用生物信息学方法对小鼠烧伤早期免疫细胞差异基因表达谱进行分析并构建蛋白互作网络，筛选在烧伤后免疫系统功能变化过程中起到重要作用的潜在生物学靶标，利用实时荧光PCR及Western blotting对所筛选的基因表达变化情况进行验证，以期从分子水平了解烧伤后免疫功能变化情况，为临床上烧伤早期诊断及治疗靶点的筛选提供新方向。
　　研究目的：
　　利用生物信息学方法对小鼠烧伤早期免疫细胞差异基因表达谱进行分析，筛选相关差异基因，并对所筛选的基因表达情况进行验证，以期找到潜在的诊断及治疗靶标。
　　研究方法：
　　1.基因芯片数据处理及分析
　　从NCBI的GEO数据库下载GSE7404数据集。对烧伤后1天的样本进行分析，共8个样本（小鼠，25％TBSAⅢ°烧伤，全血游离白细胞），其中4个为烧伤组，4个为对照组。
　　2.差异表达基因的获取
　　差异基因的获取及统计分析采用开源统计软件R3.02版本(http://www.r-project.org)进行。采用RMA(robust multiarray average)对原始数据进行背景矫正，配对样本t检验和倍比法(fold change，FC)获取差异表达基因。
　　3.功能富集分析及免疫相关差异基因蛋白互作网络的构建与分析
　　将差异基因经DAVID进行ID转换后输入到STRING9.1数据库中，选取中等可信度（交互作用评分大于0.4）的互作关系构建免疫相关差异表达基因的蛋白互作网络（Protein-protein interaction network，PPI），并对差异基因进行GeneOntology(GO)功能富集分析，网络分析及MCL子网络聚类分析采用生物图表可视化工具Cytoscape软件进行。
　　4.免疫相关基因靶标表达的检测
　　选取32只健康成年BALB/c小鼠，体重20-22g，雌雄不限。随机分为两组，第一组为假烫伤组（sham组）、37度温水。第二组为烫伤后1d组，小鼠用1％的戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔麻醉后，背部备皮，将背部脱毛区域置于97℃热水中烫伤15秒（建立三度烧伤模型），烫伤后立即腹腔注射生理盐水抗休克处理。各组小鼠按分组的时间点行眼部取血，提取血液中的白细胞，然后提取mRNA及蛋白，实时荧光PCR及Western blotting检测小鼠烧伤后白细胞中LCK、CDK1、JUN、CD19和STAT1的相对表达情况。
　　5.统计分析:
　　采用开源统计软件R3.02版本及SPSS19.0统计软件进行数据分析。原始数据进行RMA背景矫正，采用配对样本t检验和倍比法获取差异表达基因，同时满足p-value＜0.01以及|logFC|＞1，且表达量变化为2倍者为差异基因。实验数据采用SPSS19.0统计软件进行分析。
　　研究结果：
　　1.基因芯片分析结果
　　共有1825个差异基因，其中上调基因658个，下调基因1167个。
　　2.差异表达基因蛋白互作网络的构建与分析
　　将差异基因构建蛋白互作网络，该网络共有1211个节点，5176条边组成。在蛋白互作网络中位于中心位置的蛋白具有最大的互作关系，并且在疾病的进展过程中可能发挥重要的作用。在蛋白互作网络中，STAT1，JUN，LCK，CD40，STAT3，CD19，CD86，CDKn1a，CDK1以及Ptpn6基因具有最大互作关系。运用BinGo筛选PPI网络中关联紧密的模块，发现LCK、CDK1、JUN、CD19和STAT1这5个基因在相应的子网络中占据中心位置，并且在烧伤后早期免疫过程发挥重要作用。
　　3.检测小鼠烧伤早期免疫相关基因靶标的表达
　　Jun和Cdk1烧伤后第1天mRNA表达量较sham组增加(P＜0.05)，其蛋白表达量较sham组明显增加（P＜0.01）;Stat1烧伤后第1天mRNA表达量较sham组下降（P＜0.05），蛋白表达量较sham组明显下降(P＜0.01)，这与芯片数据分析结果相一致。但LCK及CD19烧伤后第1天的表达量较sham组增加，与蛋白互作网络分析结果不一致，且与sham组无统计学差异(P＞0.05)。
　　研究结论：
　　1.小鼠烧伤后细胞存在免疫系统过程、应对刺激反应等方面的紊乱。
　　2.在免疫相关基因的蛋白互作网络中，STAT1，JUN，LCK，CD40，STAT3，CD19，CD86，CDKn1a，CDK1以及Ptpn6基因具有最大互作关系。而LCK、CDK1、JUN、CD19和STAT1这5个基因在相应的子网络中占据中心位置，可能在烧伤早期免疫系统功能变化过程中起着重要的作用。
　　3.在后续的验证试验中发现STAT1、JUN和CDK1基因表达情况与数据分析结果相一致，但LCK及CD19在烧伤后第1天的变化情况较对照组比较无统计学意义。由此提示STAT1、JUN和CDK1基因可能在烧伤后免疫系统功能变化过程中起到重要作用。

目录

摘要

第一章 前言

参考文献

第二章 小鼠烧伤后免疫相关差异表达基因的筛选、蛋白互作网络的构建及分析

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

参考文献

第三章 小鼠烧伤早期免疫相关基因靶标表达的检测

3．1 材料与方法

3．1．1 主要设备及试剂

3．1．2 主要试剂

3．1．3 小鼠烫伤模型的制作

3．1．4 全血游离免疫细胞的提取

3．1．5 细胞内总RNA的提取及检测

3．1．6 RNA逆转录合成cDNA

3．1．7 Real-time qPCR扩增

3．1．8 免疫印迹法相关溶液的配制

3．1．9 凝胶的配制

3．1．10 免疫印迹(Western Blotting)

3．1．11 统计学处理

3．2 结果

3．3 讨论

参考文献

致谢

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