脑肠肽促进小鼠异基因骨髓移植后中枢T细胞重建的初步研究

摘要

目的：异基因造血干细胞移植(allo-HSCT, allogeneic hematipoietic stem celltransplantation)是治疗多种血液系统肿瘤、骨髓衰竭、遗传性疾病和某些实体
　　瘤的有效手段。本实验通过建立同种异基因小鼠的骨髓移植模型，在移植前后不同时间注射Ghrelin，测定移植后不同时间点胸腺指数、脾脏指数、T细胞各亚群(CD4+/CD8+)数量和T细胞受体删除环(TREC,T-cell receptor excision circle)表达量，初步探究Ghrelin对异基因骨髓移植后小鼠T细胞免疫重建特别是中枢免疫重建的影响。
　　方法：1.建立同种异基因清髓性骨髓移植模型供鼠为C57BL/6小鼠(H-2Kb)，受鼠为BALB/c小鼠(H-2Kd)。首先摸索出最小的清髓性辐射剂量，之后以此辐射剂量作为骨髓移植前的预处理;然后摸索出输注骨髓细胞的最佳数量，以此作为骨髓移植细胞量，检测骨髓嵌合率及观察有无GVHD发生，建立同种异基因清髓性骨髓移植模型。
　　2.在异基因骨髓移植模型的基础上进行实验，实验分为三组，移植前脑肠肽组（GG组）:骨髓移植前7天（-7d）起每日腹腔注射0.2ml（20μg）Ghrelin至移植后第28天;移植后脑肠肽组（PG组）:骨髓移植前7天至移植当天每日腹腔注射0.2ml PBS，骨髓移植第1天(1d)起每日腹腔注射0.2ml（20μg）Ghrelin至第28天;PBS对照组（PP组）:骨髓移植骨髓移植前7天起每日腹腔注射0.2ml PBS至第28天。
　　3.骨髓移植后观察小鼠的一般状况，每周测体重两次，观察GVHD的临床表现及病理改变;骨髓移植后14天、21天及28天分别测定3组小鼠的胸腺和脾脏指数;取胸腺制备组织切片，显微镜下观察其改变;用流式细胞术检测供受者骨髓嵌合率及脾脏T淋巴细胞亚群;提取胸腺及脾脏细胞DNA，用SYBRGreenⅠ法实时定量PCR(RT-PCR, real time-polymerase chain reaction)检测胸腺及脾脏细胞中TREC表达量。
　　结果：1.接受7.0Gy全身照射(TBI，total-body irradiation)的小鼠能够长期存活，而接受其他三组剂量TBI的小鼠均死于造血衰竭，表明7.5Gy为最小致死剂量，作为本实验的清髓性预处理方案。分别输注5×106及2×107个骨髓细胞进行移植，发现两组生存率无差异(P＞0.05)，但输注2×107个骨髓细胞的小鼠嵌合率更高。
　　2.骨髓移植后GG、PG、PP组体重均有下降，移植后第7天开始均有增加，体重增减幅度一致。至第28天时，GG、PG、PP组分别增加0.68g、0.19g、0g，虽然移植前后均注射Ghrelin的GG组增重较其他两组稍高，但三组间增重无统计学差异(P＞0.05)。
　　3.各组小鼠移植后28天骨髓细胞供体细胞嵌合率均达到90％以上，均无明显皮肤受损、弓背及腹泻等GVHD表现，皮肤、肝脏及小肠组织切片未见明显淋巴细胞浸润。
　　4.骨髓移植后的小鼠胸腺和脾脏指数均低于正常水平，通过比较不同组别的可以发现，在移植后同一时间段，三组小鼠胸腺和脾脏指数无统计学差异(P＞0.05);在同一组中，移植后14天、21天与28天胸腺和脾脏指数均无统计学差异(P＞0.05)。
　　5.移植后胸腺均有损伤，主要表现为组织结构受到不同程度破坏，皮质与髓质界限不清，胸腺细胞明显减少;GG组移植后14天，小鼠胸腺结构基本恢复，皮髓质分界清楚，但胸腺细胞较少;移植后21天皮质明显增厚，髓质较14天增厚，胸腺细胞密度增加;移植后28天，髓质明显增厚，且胸腺细胞密度明显增加。PG组在给药14天后，胸腺结构未见恢复，且胸腺细胞较少;给药21天后胸腺细胞有所增加，但皮髓质分界仍不清楚;28天后可见到皮质明显增厚，皮髓质分界较前清晰。仅给予PBS处理的PP组，虽然随着时间的增加，胸腺细胞有所增加，但至28天时，胸腺组织结构仍未恢复，皮髓质界限不清。
　　6.移植后14天各组小鼠T细胞亚群绝对数水平都较低;GG组移植后21天CD4+T细胞明显高于PG与PP组(P＜0.05)，移植后28天这种差异更明显(P＜0.05)，CD4+T细胞数已达到22.03±5.40×105个，CD4+T/CD8+T比值已经为2.16±0.27，几乎接近正常水平。移植后28天PG组的CD4+T细胞数较PP组高(P＜0.05)，达到13.97±3.58×105个，CD4+T/CD8+T比值为1.84±0.54，但PP组的CD4+T/CD8+T比值在移植后第28天仍是倒置的。各组T细胞绝对数的变化主要体现在CD4+T方面，CD8+T在不同时间及不同组之间均无统计学差异(P＞0.05)。
　　7.在移植后第14天，各组小鼠均无法测出脾脏TREC，胸腺TREC表达量也较低;到移植后第21天脾脏和胸腺TREC表达量有所升高，GG、PG、PP组胸腺TREC分别为0.0155±0.0101、0.0133±0.0101、0.0105±0.0056;第28天脾脏TREC继续升高，胸腺TREC反而有所下降，但是上述变化在统计学上并无差异(P＞0.05)，且三个不同处理组间在同一时间点的脾脏和胸腺TREC表达量亦无统计学差异(P＞0.05)。然而从表达水平上看，胸腺中的TREC表达量明显高于脾脏中的(P＜0.05)。
　　结论：1.BALB/c小鼠接受X射线TBI的最小致死剂量是7.5Gy，输注骨髓细胞输注5×106、2×107个骨髓细胞生存率无差异，后者小鼠嵌合率更高，基于后者建立的骨髓移植模型，无GVHD的发生，是研究移植后免疫重建的良好模型。
　　2.异基因骨髓移植后注射Ghrelin对小鼠体重无影响，对移植后28天内的胸腺和脾脏TREC表达量无影响，不能改善胸腺近期输出初始T细胞的功能。而移植后胸腺功能的恢复是移植后免疫重建的重要环节，需要进一步研究Ghrelin在移植28天后对胸腺功能的影响。
　　3.异基因骨髓移植后连续注射Ghrelin可以促进胸腺结构恢复，增加胸腺细胞密度及脾脏CD4+T数量;但移植前7天就开始连续注射Ghrelin的小鼠胸腺结构恢复较快，胸腺细胞密度更高，脾脏CD4+T数量也更多，说明Ghrelin可促进小鼠异基因骨髓移植后免疫重建，且移植前注射Ghrelin对TBI造成的胸腺损伤有一定的保护作用。Ghrelin免疫重建的促进作用有望应用于临床，并可能成为未来克服移植后免疫重建延迟的重要途径。

目录

摘要

第一章 研究背景

1．1．异基因造血干细胞移植后免疫重建的特点

1．2．异基因造血干细胞移植后T细胞在胸腺中的发育

1．3．异基因造血干细胞移植后胸腺功能重建的影响因素

1．4．异基因造血干细胞移植后提高胸腺功能的治疗策略

1．5．脑肠肽Ghrelin对胸腺功能的影响

第二章 研究目的

第三章 小鼠异基因骨髓移植模型的建立

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 实验结果

第四章 Ghrelin对小鼠骨髓移植后免疫重建的影响

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．3 统计学分析

4．4 实验结果

第五章 讨论

第六章 结论

参考文献

攻读学位期间成果

中英文缩略词表

致谢

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