microRNA-30e在脓毒症急性肺损伤中的表达及其调节炎症反应机制的研究

摘要

目的:1.探讨脓毒症大鼠受损肺组织及脂多糖诱导的大鼠肺泡巨噬细胞不同时间点miR-30e的表达及其与炎症因子表达的相关性;
　　2.探讨被上调或下调的miR-30e对LPS诱导的巨噬细胞炎症反应发挥的作用;
　　3.初步探讨上调或下调的miR-30e对LPS诱导的巨噬细胞炎症反应发挥作用的机制。
　　方法:1.建脓毒症大鼠模型，观察大鼠一般情况，采集肺组织标本，分析肺组织病理结构的变化，判断模型是否构建成功。用RT-qPCR方法检测脓毒症大鼠肺组织中miR-30e和炎症指标的表达情况，并分析两者的相关性;
　　2.构建NR8383细胞（肺泡巨噬细胞）的脓毒症模型，在LPS刺激的NR8383细胞0h、3h、6h、12h、24h五个时间点检测miR-30e和炎症因子表达水平的变化，并分析两者的相关性;
　　3.采用microRNA靶基因预测软件Targetscan和RNAhybrid数据库对rno-miRNA-30e-5p进行靶基因预测，以两个或以上软件共同预测结果作为其候选靶基因。对miR-30e及靶基因进行生物信息学分析，预测其结合位点及相关信号通路，在LPS处理的肺泡巨噬细胞中用Western Blot方法检测靶蛋白的表达;
　　4.将miR-30e mimics/inhibitor转染至NR8383细胞，用RT-qPCR方法检测炎症因子的mRNA水平的表达改变，ELISA法检测炎症因子的蛋白水平表达改变，并用Western Blot检测靶蛋白的表达;
　　5.统计方法:用SPSS23.0统计软件分析数据，计量资料用均数±标准差（(x)±S）表示，多组样本均数比较用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05，为差异有统计学意义。相关性检验，当双变量都服从正态分布时采用Pearson相关分析，不服从时则采用Spearman相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果:1.大鼠脓毒症模型的建立及肺组织的病理改变。正常对照组大鼠一般情况良好，活动自如，呼吸平稳，饮食饮水未见异常，对外界刺激的反应正常。LPS处理组大鼠在LPS注射后30分钟开始出现躁动不安，心率、呼吸频率显著加快;LPS注射后3小时，呼吸急促症状明显，四肢、唇鼻紫绀，体温上升，并出现精神反应差、蜷缩懒动、肌张力下降、不思饮食、嗜睡、竖毛、腹泻、对外界刺激反应减弱等内毒素血症表现，部分大鼠口鼻有红色泡沫样液体溢出。肺组织石蜡切片HE染色显示:各脓毒症组大鼠肺组织可见结构破坏，肺泡膨胀不全、肺泡融合或塌陷，肺泡腔内有渗出液;肺泡间隔明显增厚，可见大量炎性细胞浸润;肺组织毛细血管扩张、淤血，管腔内充满红细胞，甚至有血栓形成，随着脓毒症炎症损伤时间的延长，肺组织损伤程度不断加重。
　　2.脓毒症大鼠肺组织miR-30e、炎症因子改变，及两者之间的相关性。各脓毒症组大鼠肺组织miR-30e表达水平相比正常对照组均明显下调，且具有明显统计学差异(P＜0.01)，其中模型组24h下调最明显;脓毒症组3h、6h、12h、24h IL-1β、TNF-α相对表达水平与正常对照组相比均显著上升(P＜0.01)，且在脓毒症3h时达到最高峰，随后开始下降，但与正常对照组相比仍然明显上调且有统计学意义。各实验组大鼠肺组织中miR-30e与IL-1β水平呈负相关性(r=-0.417，P=0.022)，与TNF-α水平也呈负相关性(r=-0.437，P=0.016)。
　　3.LPS刺激NR8383细胞后不同时间点细胞中miR-30e、炎症因子的表达改变，及两者之间的相关性。LPS刺激3、6、12、24小时后miR-30e表达水平相比空白对照组均明显下调，且具有明显统计学差异(P＜0.01)。其中LPS3h组下调最明显;LPS刺激3、6、12、24小时后IL-1β、TNF-α相对表达水平相比空白对照组均显著上升(P＜0.01)，且同脓毒症大鼠肺组织结果一致，在LPS3h组时达到最高峰，随后开始下降，但与空白对照组相比仍然明显上调且有统计学意义。LPS刺激NR8383细胞后不同时间点细胞中miR-30e的表达水平与IL-1β水平呈负相关性（r=-0.713，P=0.003），与TNF-α水平也呈明显负相关性(r=-0.712，P=0.002)。
　　4.miR-30e靶基因的预测及验证。生物信息学预测结果显示，miR-30e5'端种子区与Notch1 mRNA3'UTR区互补结合，提示Notch1基因很可能是miR-30e作用的靶基因，为后续的实验提供了理论基础。LPS刺激NR8383细胞6、12、24小时后细胞中Notch1蛋白含量灰度值均较LPS0h、LPS3h组明显上调，随着刺激时间的延长，Notch1蛋白表达逐渐增加，且均具有统计学差异(P＜0.05)，LPS+miR-30e m组较LPS+NC m组Notch1蛋白的表达水平明显降低，差异有统计学意义(t=33.767，P＜0.01);LPS+miR-30e i组较LPS+NC i组Notch1蛋白的表达水平明显升高，差异亦有统计学意义(t=-11.371，P＜0.01)，表明Notch1蛋白表达受到miR-30e的调控。
　　5.miR-30e对LPS诱导肺泡巨噬细胞NR8383炎症反应发挥的作用。LPS+miR-30e m组较LPS+NC m组TNF-α、IL-1β的mRNA表达水平明显降低(TNF-α:t=19.574，P＜0.01; IL-1β: t=3.477，P=0.025);与LPS+NC i组相比较，LPS+miR-30e i组TNF-α、IL-1β的mRNA表达水平明显升高(TNF-α:t=-6.606,P＜0.01; IL-1β: t=-3.457，P=0.026)。LPS+miR-30e m组较LPS+NC m组的TNF-α、IL-1β的蛋白表达水平明显降低(TNF-α:t=5.899，P=0.004;IL-1β: t=5.107，P=0.007);而与LPS+NC i组相比较，LPS+miR-30e i组TNF-α、IL-1β的蛋白表达水平明显升高，差异亦有统计学意义(TNF-α:t=-6.785，P=0.002; IL-1β: t=-3.662, P=0.022)。
　　结论:1.本研究通过体内和体外两个层面发现:miR-30e在脓毒症诱导急性肺损伤发生时的表达量显著下调，并与炎症因子IL-1β、TNF-α表达水平呈明显负相关;
　　2.miR-30e很可能部分通过Notch1负性调节巨噬细胞的炎症反应，而Notch1信号通路在其中的具体作用机制尚有待于进一步探索。

目录

摘要

前言

第一章 microRNA-30e在脓毒症急性肺损伤中的表达及与炎症因子水平的相关性

引言

第一节 材料与方法

第二节 结果

第三节 讨论

第二章 mircoRNA-30e靶向Notch1负性调节LPS诱导的炎症反应

引言

第一节 材料与方法

第二节 结果

第三节 讨论

参考文献

攻读硕士期间研究成果

致谢

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