PCR技术检测藻类16SrDNA特异性片段在溺死诊断中的应用

摘要

目的：本研究主要通过酶消化法联合MoBio强力土壤DNA提取试剂盒(PowerSoilTM DNA Isolation Kit)提取藻类DNA，可直接用于下游实验;选用针对蓝藻、硅藻、绿藻等多种藻类特异性引物，扩增藻类16SrDNA中V3，V4区特异性片段，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳及PCR产物测序，验证引物特异性。微波消解-真空抽滤-电镜扫描法是一种可靠的灵敏度高、特异性强的硅藻形态学检验方法，检测溺死样本具有较高的阳性率，但在检验的过程中破坏了蓝藻、绿藻的溺死相关藻类。本研究使用针对多种随溺液进入体循环的溺死相关藻类16SrDNA的特异性引物，检测微波消解-真空抽滤-电镜扫描法检测过的案例样本，并与微波消解-真空抽滤-电镜扫描法检测结果作比较，希望通过联合使用两种方法在水中尸体样本中发现多种溺死相关藻类，为溺死诊断提供新的思路。本研究同时应用毛细管电泳检测溺死相关藻类16SrDNA基因，由于毛细管电泳法应用广泛、操作简单，在溺死鉴定中易普及推广，希望为溺死诊断提供一种新方法。
　　方法：实验材料(1)实验动物样本35只实验兔随机分为3组:生前入水组(溺死组)15只，死后入水组（空气栓塞致死后入水）15只，以及对照组（空气栓塞死后不作处理）5只;(2)水中尸体样本共64份包括20例微波消解-真空抽滤-自动电镜扫描法检测水中尸体硅藻阳性样本（58份样本，其中肺脏、肝脏、肾脏样本分别为18、20、20份），6份微波消解-真空抽滤-自动电镜扫描法检验的水中尸体阴性肝脏样本，同时记录案例样本的腐败程度。(3)引物特异性验证样本7种已知溺死相关的藻类（直链藻、菱形藻、针杆藻、舟形藻，铜绿微囊藻，小环藻，小球藻）及白色念珠菌（真菌）、肉毒梭状芽孢杆菌（细菌）样本，人基因组DNA、兔基因组DNA，用于验证引物特异性。
　　DNA提取使用酶消化法与PowerSoilTM DNA Isolation Kit试剂盒提取组织样本（实验兔、人体案例组织），水样中的藻类DNA及引物特异性验证样本DNA。
　　PCR产物的检测及检验方法的比较(1)使用PCR-聚丙烯酰氨凝胶电泳法(PCR-PAGE)检测各组实验兔脏器中溺死相关藻类DNA，比较3组实验兔各脏器之间藻类检出率(2)使用PCR-毛细管电泳法(PCR-CE)检测溺死组实验兔脏器中溺死相关藻类，比较PCR-PAGE与PCR-CE两种方法在检测溺死组实验兔PCR产物阳性率，记录并比较两种电泳方法检测PCR产物电泳过程中电泳前准备时间、电泳后结果分析时间，同时比较两种方法检测PCR产物的各自特点;(3)PCR-CE检测收集的微波消解-真空抽滤-电镜扫描法检测的水中尸体脏器硅藻阳性样本共58份，6份水中尸体硅藻阴性肝脏样本，同时记录每份样本中硅藻数量，将PCR-CE法与微波消解法结果进行比较。
　　结果：实验兔样本结果:
　　PCR-PAGE法检测3组实验兔生前入水组肺检出率最高，肝、肾检出率次之，分别为100％，86％，86％;实验兔死后入水组肺、肝、肾检出率分别为13％，0％，0％;对照组肺、肝、肾藻类未检出。PCR-PAGE法检测生前入水组与死后入水组各种脏器中藻类检出率经统计学检验差异显著(P＜0.05)。
　　PCR-CE法检测溺死组实验兔肺脏、肝脏、肾脏藻类检出率分别为100％，86％，86％，PCR-PAGE与PCR-CE法检测溺死组实验兔结果相比，两者在肺脏、肝脏、肾脏之间具有相同的阳性率，不具统计学意义(P＞0.05);PCR-CE法与PCR-PAGE法检测PCR产物在电泳前准备用时及电泳结果后分析用时相比，明显少于PAGE电泳法(P＜0.05)，且操作更加方便、简洁，处理多份样本有较好优势，结果容易储存。
　　水中尸体样本藻类检出率结果:PCR-CE法检测经微波消解-真空抽滤-电镜扫描法检测过的20例共58份水中尸体硅藻阳性样本藻类检出率分别为:肺脏检出率最高为100％，肝，肾次之，分别为60％，60％。PCR-CE法在肾脏、肝脏样本的藻类检出率与微波消解-真空抽滤-电镜扫描法（肺、肝、肾均为100％）相比，两种方法阳性率比较具有统计学差异(P＜0.05)，即微波消解-真空抽滤-电镜扫描法阳性率明显高于PCR-CE法，其中PCR-CE法检测腐败程度较高的肝脏、肾脏样本中不易检出藻类DNA;两种方法在肺脏之间藻类检出率不具有统计学差异(P＞0.05);通过对PCR-CE法检测的部分阳性样本进行测序表明，在硅藻含量较少的一些样本中同时存在蓝藻。PCR-CE法检测微波消解-真空抽滤-电镜扫描法检测后6份硅藻检验为阴性样本1份新鲜检材藻类检测为阳性，测序结果显示为蓝藻。
　　引物特异性检测结果:PAGE法检测7种溺死相关藻类DNA（直链藻、菱形藻、针杆藻、舟形藻，铜绿微囊藻，小环藻，小球藻）检测结果为阳性;检测人基因组DNA、兔基因组DNA，白色念珠菌（真菌）DNA，肉毒梭状芽孢杆菌（细菌）DNA均为阴性。
　　结论：实验兔结果表明PCR-PAGE法检测溺死相关藻类16SrDNA基因片段可以区分生前入水和死后入水;2例死后入水组实验兔肺脏中检测结果为阳性可能由于水的压力作用下经呼吸道进入肺脏中所致，因此只有肺脏中含有藻类时，对于进行溺死诊断要谨慎。
　　PCR-PAGE与PCR-CE法检测溺死实验兔结果相比，虽然两者具有相同的阳性率，但实验过程中PCR-CE法与PCR-PAGE法检测PCR产物相比，电泳前准备时间及电泳后结果分析时间均较为省时，且操作更加方便、简洁，结果容易储存等优点，对于处理多份样本有较好的优势。
　　对20例水中尸体样本研究结果表明，较新鲜的检材使用PCE-CE法检测溺死相关藻类易检出，而腐败较为严重的检材不易检出，导致本方法检测案例尸体脏器样本中肝脏、肾脏中的藻类检出率低于微波消解-真空抽滤-电镜扫描法。使用PCE-CE法检测水中尸体案例样本研究表明，对一些水中尸体案例样本中硅藻检测数量含量较少（通过微波消解-真空抽滤-电镜扫描法检测记录脏器中硅藻数量）的样本，也含有其它的溺死相关藻类如蓝藻（通过对PCR-CE法检测为阳性的样本进行产物测序）。因此，通过PCR技术检测多种溺死相关藻类同时联合微波消解-真空抽滤-电镜扫描法检验硅藻，有望为溺死的诊断提供可靠的信息，为溺死诊断提供新思路。

目录

摘要

第一章 引言

1．1 溺死定义及溺死鉴定现状

1．2 硅藻检验在溺死诊断中的应用

1．2．1 硅藻提取方法

1．2．2 硅藻的检测方法

1．3 蓝藻、绿藻等溺死相关藻类在溺死诊断中的应用

1．4 其它方法在溺死诊断中的应用研究

1．4．1 电解质分析

1．4．2 化学物质

1．5 PCR技术(分子生物学技术)检测藻类在溺死诊断中的应用

1．6 研究意义

第二章 PCR-PAGE检测溺死相关藻类16SrDNA方法建立

2．1 材料

2．1．1 主要仪器

2．1．2 主要试剂及耗材

2．1．3 实验兔分组

2．1．4 实验动物模型制作

2．1．5 样本来源

2．2 法

2．2．1 水样内藻类DNA的提取

2．2．2 动物组织内藻类DNA的提取

2．2．3 PCR扩增

2．2．4 PAGE电泳产物检测

2．2．5 DNA产物测序分析

2．3 结果

2．3．1 PCR-PAGE检测7种标准藻类产物结果

2．3．2 PCR扩增人、兔、真菌、细菌基因PAGE图

2．3．3 3组实验兔脏器PAGE结果

2．3．4 PCR产物测序

2．4 讨论

第三章 毛细管电泳检测PCR产物在溺死诊断中的研究

3．1 材料

3．1．1 主要仪器

3．1．2 主要试剂及耗材

3．1．3 样本来源

3．2 方法

3．2．1 水样及动物组织中藻类DNA提取

3．2．2 PCR扩增

3．2．3 毛细管电泳

3．3 结果

3．3．1 7种常见溺死相关藻类毛细管电泳所测产物迁移率

3．3．2 溺死组实验兔结果

3．3．3 毛细管电泳与PAGE两种方法检测PCR产物特点比较

3．3 讨论

第四章 PCR-CE与微波消解-真空抽滤-电镜扫描法在水中尸体案例脏器藻类检出结果比较

4．1 样本来源

4．2 微波消解-真空抽滤-电镜扫描法主要材料及方法

4．2．1 材料及试剂

4．2．2 方法

4．3 微波消解-真空抽滤-电镜扫描法检测案例样本结果

4．4 PCR-CE法检测尸体脏器组织样本

4．4．1 主要仪器

4．4．2 主要试剂及耗材

4．4．3 方法

4．4．4 PCR-CE法检测尸体案例脏器结果

4．5 讨论

全文小结

存在的问题和展望

参考文献

附录

研究生期间研究成果

致谢

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