姜黄素激活Akt信号通路增强PRDX3蛋白的表达减轻布比卡因诱导的SH-SY5Y细胞的神经毒性

摘要

布比卡因是临床局部麻醉和疼痛治疗的常用药物，但可引起神经细胞凋亡，从而产生神经毒性，导致感觉和运动障碍，给患者的生产生活带来明显不良影响。
　　本科研小组构建布比卡因损伤人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞模型，通过细胞形态、细胞活力、细胞凋亡率和细胞内ROS水平以及线粒体膜电位等指标的变化明确姜黄素的神经保护作用;同时探讨Akt信号通路的激活是否与姜黄素的神经保护作用有关，而且运用小干扰RNA等分子生物学技术研究PRDX3蛋白在姜黄素减轻布比卡因所致的SH-SY5Y细胞的损伤中的作用。本研究明确其机制有利于今后减轻围手术期患者应用局麻药后神经毒性损伤，也为临床麻醉防治局麻药神经损伤提供了新的靶点和思路，为临床防治局麻药神经损伤提供新的理论依据。
　　第1章 布比卡因损伤SH-SY5Y细胞模型的构建
　　目的：构建布比卡因损伤SH-SY5Y细胞模型。
　　方法：体外培养SHSY5Y细胞，分为6组，C组为对照组（未经药物处理），Bup0.5～Bup2.5组(分别用0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mM布比卡因的培养液处理24h)。观察细胞形态，采用MTT法检测细胞活力，TUNEL检测细胞凋亡，确定布比卡因的适宜浓度，建立布比卡因细胞损伤模型。
　　统计学处理计量资料以均数±标准差（(x)±s）表示，采用SPSS17.0统计学软件进行分析。组内比较采用重复测量设计的方差分析，细胞活力和凋亡率组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果：布比卡因处理24h后，各实验组不同浓度的布比卡因对SH-SY5Y细胞活力均有明显影响，细胞活力明显下降，且随剂量增加，细胞活力下降明显增加。Bupi0.5～Bupi2.5组细胞活力分别下降至82％、70％、53％、43％和25％。各实验组细胞在布比卡因处理后细胞凋亡率明显增加，且随着浓度的增加，细胞凋亡率也明显增加。Bup0.5～Bup2.5组细胞凋亡率分别为20％、26％、37％、51％和62％。0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mM。
　　结论：布比卡因对SH-SY5Y细胞有损伤作用，且随浓度的增加，损伤程度加重。在本实验中，我们测得布比卡因LD50为1.477 mM，所以我们选择1.5mM布比卡因建立SH-SY5Y细胞损伤模型。
　　第2章 姜黄素对布比卡因诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用
　　目的：确定对布比卡因诱导的SH-SY5Y细胞损伤有保护作用的姜黄素浓度。
　　方法：体外培养SHSY5Y细胞，分为12组，C组为对照组（未经药物处理），Bup组(各组Bup浓度均为1.5mM)，Bup+Cur0.5组，Bup+Cur1.0组，Bup+Cur2.0组，Bup+Cur5组，Bup+Cur10组（在布比卡因培养液处理细胞之前加入姜黄素处理24h），Cur0.5组，Cur1.0组，Cur2.0组，Cur5组，Cur10组(仅加入姜黄素处理24h)。观察细胞形态，采用MTT法检测细胞活力，TUNEL检测细胞凋亡，确定布姜黄素对布比卡因神经毒性的保护作用，并确定有保护作用的姜黄素浓度。
　　统计学处理采用SPSS13.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（(x)±s）表示。组内比较采用重复测量设计的方差分析，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果：姜黄素预处理24h后，对各实验组SH-SY5Y细胞活力均有明显影响。Bup+Cur0.5～Bup+Cur10组细胞活力分别为70％，90％，75％，60％，52％。Cur0.5～ Cur10组细胞活力分别为98％，99％，85％，65％，58％。对照组、Cur1.0组、Bup组和Bup+Cur1.0组细胞凋亡率分别为10％，11％，32％和20％。与Bup组比较，Bup+Cur1.0组细胞凋亡率明显升高，差异有统计学意义。
　　结论：1μM和2μM的姜黄素预处理24h后明显减轻布比卡因导致的细胞活力降低，5μM和10μM的姜黄素没有细胞保护作用。而且1μM和2μM的姜黄素的神经保护作用无统计学差异。但与对照组比较，姜黄素浓度为2μM时细胞毒性明显增加，所以我们确定姜黄素对布比卡因神经毒性有保护作用，并选择姜黄素浓度为1μM进行后续的实验。
　　第3章 Akt信号通路在姜黄素减轻布比卡因诱导的SH-SY5Y细胞损伤中的作用
　　目的：探讨Akt信号通路是否与姜黄素对布比卡因诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用有关。
　　方法：体外培养SHSY5Y细胞，分为6组，C组为对照组（未经药物处理），Bup组，Cur组，Bup+Cur组，Bup+Tri组，Bup+Cur+Tri组（在布比卡因培养液予以Akt特异性阻断剂triciribine1μM处理30min，再入姜黄素处理布比卡因培养液24h)。采用流式细胞仪检测细胞ROS水平和线粒体膜电位、TUNEL检测细胞凋亡、蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Akt、p-Akt、Bax、Bcl-2、caspase-9表达水平，检测PRDX3蛋白表达水平和mRNA水平，并进行了PRDX3免疫荧光检测。
　　统计学处理采用SPSS13.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（(x)±s）表示。组内比较采用重复测量设计的方差分析，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果：姜黄素预处理24h后，布比卡因诱导的SH-SY5Y细胞损伤减轻。Bup组p-Akt/Akt约为0.3，与Bup+Cur组比较，明显降低;Bup组Bel-2/Bax值约为0.55，与Bup+Cur组比较，明显降低;Bup组Casepase-9/GAPDH约为1.8，与Bup+Cur组比较，明显升高降低。与Bup+Cur组比较，Bup+Cur+Tri组p-Akt/Akt值约为0.6，明显降低;Bup+Cur+Tri组Bcl-2/Bax值约为0.6，显著降低;Bup+Cur+Tri组Casepase-9/GAPDH约为2.1，显著升高。与Bup组比较，Bup+Cur组线粒体ROS水平明显降低;与Bup+Cur组比较，Bup+Cur+Tri组线粒体ROS水平明显升高。与C组比较，Bup组和Bup+Tri组PRDX3蛋白表达水平和mRNA水平均明显降低，差异有统计学意义;与Bup组比较，Bup+Cur组PRDX3蛋白表达水平和mRNA水平明显升高，差异有统计学意义;与Bup+Cur组比较，Bup+Cur+Tri组PRDX3表达蛋白水平和mRNA水平明显降低，差异有统计学意义。
　　结论：Akt信号通路的激活与姜黄素减轻布比卡因诱导的SH-SY5Y细胞损伤有关。
　　第4章 PRDX3蛋白在姜黄素减轻布比卡因诱导的SH-SY5Y细胞损伤中的作用
　　目的：探讨姜黄素对布比卡因诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用是否与增强抗氧化蛋白PRDX3有关
　　方法：采用小于扰mRNA技术培养Prdx3siRNA转染细胞，分为3组，Prdx3siRNA转染细胞（对照组C组）、Prdx3siRNA转染细胞+Bup组(Bup组)，Cur+Prdx3siRNA细胞+Bup(Bup+Cur组)。Cur组加入加入姜黄素处理24h，除去姜黄素后再加入1.5mM布比卡因24h。采用TUNEL检测细胞凋亡、蛋白免疫印迹法(Western blot)检测PRDX3、Bcl-2、Bax和caspase-9蛋白表达水平，q-PCR检测PRDX3 mRNA表达水平。
　　统计学处理采用SPSS13.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（(x)±s）表示。组内比较采用重复测量设计的方差分析，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果：与C组比较，Bup组PRDX3表达明显减少，差异有统计学意义，Bup+Cur组PRDX3表达略有减少，差异无统计学意义;与C组比较，Bup组Bax蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义，Bup+Cur组蛋白表达水平略有减少，差异无统计学意义;与C组比较，Bup组Bcl-2蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义，Bup+Cur组蛋白表达水平略有减少，差异无统计学意义;与C组比较，Bup组caspase-9蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义，Bup+Cur组蛋白表达水平略有减少，差异无统计学意义。
　　结论：姜黄素对布比卡因诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用与抗氧化蛋白PRDX3表达水平增强有关。

目录

摘要

前言

第1章 布比卡因损伤SH-SY5Y细胞模型的构建

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

第2章 姜黄素对布比卡因诱导的SH-SYSY细胞损伤的保护作用

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

第3章 Akt信号通路在姜黄素减轻布比卡因诱导的SH-SY5Y细胞损伤中的作用

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

第4章 PRDX3蛋白在姜黄素减轻布比卡因诱导的SH-SY5Y细胞损伤中的作用

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

全文结论

参考文献

综述 高血糖的神经毒性及其对基因损伤修复影响的机制研究进展

中英文对照缩略词表

攻读学位期间成果

致谢

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