YD277：一个全新的小分子化合物在三阴性乳腺癌的功能和机制的研究

摘要

目的：
　　本课题主要通过体内体外各种生物学方法，探究YD277的抑癌效果和机制，并且为三阴性乳腺癌的治疗提供新化疗药物和方向。
　　方法：
　　1.SRB法检测细胞生存率，反应药物抑制癌细胞效果。首先得到ML264衍生物24个，以10μM浓度在细胞系HCT116，MDA-MB-231，HCC1806进行处理48小时，镜下可见大量漂浮变圆的凋亡细胞。甩干培养基后经过TCA固定，晾干，SRB染色，1％冰醋酸洗脱晾干，10mM Tris base溶解处理，酶标仪检测吸光值，筛选出有效的抑癌药物YD277。使用潜在抑癌药物YD277以不同的浓度在MCF10A，MCF7，T47D，SUM149PT，MDA-MB-231, MDA-MB-453, MDA-MB-468, Hs578t, HCC1806,HCC1937，十株细胞系验证抑癌效果，再次使用SRB的方法测定准确每株细胞系准确的IC50。最后根据实验需要选出MDA-MB-231，MDA-MB-468作为研究的代表细胞系，作为后续实验的材料。
　　2.EdU检测细胞增殖
　　为了检测药物YD277影响细胞增殖情况，使用MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞系，以不同浓度YD277（0，3，10μM）处理24小时，以ML264（10μM）作为对照，然后用Click-iT EdU试剂盒进行处理，最后封片拍照，所得结果用ImageJ和IPP软件处理，从每个处理结果中选择3张图片，从中选取10个区域进行统计，所得比值作为最后结果。
　　3.细胞凋亡分析
　　为了论证YD277引起细胞增殖减少的原因，使用流式方法检测药物YD277引起细胞凋亡情况。使用MDA-MB-231和MDA-MB-468铺板，用YD277不同浓度（0，1，3，10μM），ML264(10μM)作为对比，处理36小时后胰酶消化，每个细胞系分出三个对照组。离心去上清，用700ul Anti-AnnexinⅤ Binding buffer洗两次，之后分别用AnnexinⅤ避光染色30 min，离心，700 ul Binding buffer洗两遍，PI染色，直接Accuri C6(BD)上机分析凋亡比例。
　　4.细胞周期试验
　　为了论证YD277引起肿瘤细胞增殖减少机制，使用流式方法检测该药物对细胞周期阻滞的影响。使用MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞系进行铺板，然后用YD277不同浓度(0，1，3，10μM)处理36小时，胰酶消化，用PBS洗两次，离心去上清。
　　5.蛋白印迹检测一般周期和凋亡相关的蛋白的改变，用以探索凋亡机制。为了探讨细胞周期和凋亡改变的机制，做了大量蛋白筛，使用MDA-MB-231和MDA-MB-468用不同浓度YD277（0，1，3，10μM）处理36小时，用细胞裂解液裂解，4℃，30 min，离心，蛋白定量，然后加4XSDS Loading Buffer，100℃5min煮样，上样，跑胶分离蛋白，转膜，各种抗体孵育14小时，二抗孵育2小时，曝光仪检测检测各个目标条带变化情况。
　　6.ER-STRESS通路探讨和验证
　　经过筛查细胞凋亡通路蛋白，发现内质网积压通路蛋白有明显变化。尤其是TRAF-ASK-IRE1α通路变化显著。在10cm培养皿种板MDA-MB-231和MDA-MB-468，贴壁后瞬时转染siBIP，siIRE1α，siJnk(total)50nM浓度，24小时后消化，种板到48孔板。次日以多个浓度YD277(0.3-12μM)处理48小时，SRB检测细胞增殖情况，计算比较IC50的改变。
　　7.动物实验
　　检测药物体内抑癌活性，对评价药物作用有重要价值。购买4周龄雌性裸鼠，养一周适应新环境后，用MDA-MB-231细胞系，按单侧1X106，进行双侧成瘤，一周后肿瘤生长均匀，当肿瘤体积达到10mm3进行随机分组。分成安慰剂组8只小鼠，YD27715mg/Kg处理组8只小鼠，YD27725mg/Kg处理组10只。阳性对照组（盐酸表柔比星8mg/kg每两天一次）4只小鼠作为实验技术性对照。该实验的目的是评价药物YD277在活体的治疗作用和毒理作用。
　　结果：
　　1.通过SRB实验检测细胞增殖率，以HCT116，MDA-MB-231，HCC1806三株结直肠癌和乳腺癌细胞作为筛选细胞系，从24个ML264衍生物中筛选出YD277作为潜在有效的研究药物。癌细胞对这个药物更加敏感，YD277是一个很有可能成为新的抗肿瘤新药，因此需要充分研究该药物的抑癌机制和抑癌效果。通过细胞系筛查，得到MDA-MB-231和MDA-MB-468的IC50在1.5-3μM之间。由于倾向研究三阴性乳腺癌的研究，并且MDA-MB-231易于活体成瘤，所以选择这两个细胞作为研究细胞系，作为进行后续各项实验的材料。
　　2.EdU细胞增殖实验显示，YD277显著抑制乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468的DNA合成，减少细胞分裂，证明细胞增殖受到抑制。通过EdU实验发现，用不同剂量的YD277(0，3，10μM)和母合药物ML264(10μM)作为对照，处理24小时后，检测发现两株癌细胞在YD277作用下，DNA合成能力显著下降，细胞分裂减慢，细胞增殖显示出随药物浓度增加梯度下降。母合结构ML264在24小时的处理时间不能显著减少DNA合成。
　　3.流式凋亡实验证明，YD277明显导致MDA-MB-231和MDA-MB-468两株三阴性乳腺癌凋亡细胞比例增加。通过以不同剂量的YD277处理(0，1，3，10μM)，母合药物ML26410μM作为对照，处理36小时后，镜下可见药物处理细胞系明显变形，漂浮，可见凋亡细胞。然后MDA-MB-231和MDA-MB-468分别用PI和AnnexinⅤ双染，流式检测凋亡比例。结果显示随着YD277浓度的升高，两株细胞的早期凋亡和晚期凋亡的比例显著升高，显示剂量效应。
　　4.流式周期检测显示，YD277明显导致MDA-MB-231和MDA-MB-468两株三阴性乳腺癌G1期阻滞，抑制肿瘤细胞的生长。通过不同剂量的YD277(0，1，3，10μM)，以母合药物ML264(10μM)作为阳性对照进行对比，药物处理36小时，然后流式检测细胞周期，发现随着药物浓度的提高，YD277显著引起G1期阻滞。结果跟镜下显示一致，因为YD277不仅导致细胞凋亡，还能导致细胞分裂减少，这可能部分是由于周期阻滞造成的。
　　5.使用蛋白印迹实验经过大量通路筛查表明，YD277明显导致三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468一系列周期，凋亡和一些细胞信号通路蛋白的变化。通过不同剂量的YD277（0，1，3，10μM）和母合药物ML26410μM处理36小时后，用细胞裂解液处理细胞，收蛋白。蛋白Bip，IRE1α，p-Jnk，p-C-Jun，CL-c3有显著性变化，提示YD277可能部分通过诱导ER-STRESS介导细胞凋亡。
　　6.药物YD277可以部分通过ER-STRESS诱导肿瘤细胞凋亡。为了验证这个观点，使用瞬时转染的方法，敲低基因Bip，IRE1α，Jnk(total)24小时后，重新铺板贴壁后，以不同浓度YD277处理，发现当敲低IRE1α后，IC50显著性升高（10μM），而敲除Bip和tJnk后，挽救效果不如敲低IRE1α。该实验说明，IRE1α在YD277导致的细胞凋亡过程中发挥重要作用。
　　7.动物实验表明，YD277能有效抑制小鼠体内移植瘤生长。经过每隔一天，腹腔给药28天的方式处理荷瘤裸鼠之后，发现与安慰剂相比，药物 YD277在浓度15mg/Kg和25mg/Kg两组能显著抑制活体移植瘤(MDA-MB-231)的生长，药物吸收良好。对小鼠的体重影响没有显著性差异。动物实验有效说明经过动物体循环之后，药物效果没有发生很大变化，抑癌效果依然显著。
　　结论：
　　YD277是一个新型的，能有效抑制三阴性乳腺癌增殖的小分子化合物。在体外实验中，YD277在1.5-3μM的处理浓度能有效抑制大多数乳腺癌细胞系增殖，导致周期阻滞在G1期，减少细胞分裂，诱导凋亡。然而它在这个浓度不影响正常乳腺上皮细胞系MCF10A生长。生物学实验和蛋白印迹实验证明YD277能有效导致细胞凋亡。其导致凋亡部分是通过诱导ER-STRESS，激活IRE1α蛋白来实现的，但是具体YD277是如何介导ER-STRESS的发生还有待进一步探索。在体内试验，药物浓度为15mg/Kg的YD277能有效抑制移植瘤（三阴性乳腺癌）的生长，对小鼠机体影响小，主要器官变化不大，其毒性显著低于临床常规治疗药物表柔比星。因此，YD277是一个值得研究的，有望成为下一代临床治疗乳腺癌的新化疗药物，并且为三阴性乳腺癌抑癌机制提供新思路。

目录

摘要

前言

第一节 实验材料

1．1 主要仪器

1．2 实验细胞和动物平台

1．3 ML 264及其衍生物和YD277-Biotin合成

1．4 主要试剂

1．5 实验中相关试剂配方

第二节 实验方法

2．1 细胞培养技术

2．2 细胞计数

2．3 药物配制和加药方法

2．4 SRB法检测药物对细胞生长的影响

2．5 细胞转染

2．6 EdU渗入法检测细胞DNA合成与细胞增殖

2．7 AnnexinV-FITC／PI双染检测细胞凋亡

2．8 PropidiμM Iolide单染检测细胞周期

2．9 WESTERN BLOTING检测蛋白表达

2．10 银染实验

2．11 动物实验(移植瘤抑制试验)

2．12 肿瘤固定和病理学检查

2．12 统计学分析

第三节 结果

3．1 筛选有效ML264衍生物

3．2 验证YD277在多株肿瘤细胞的抑癌效果并检测准确IC50

3．3 YD277的分子结构

3．4 YD277不能抑制KLF5的表达

3．5 YD277导致乳腺癌G1期阻滞

3．6 EdU碱基插入实验

3．7 细胞凋亡实验

3．8 YD277引起细胞调亡机制一般性探索

3．9 YD277通过ER-sTRESS途径诱导细胞iI爵亡

3．10 YD277靶点探索

3．11 移植瘤抑制试验

第四节 讨论

参考文献

攻读硕士期间成果

致谢

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