雌激素通过TRAIL抑制TNF-α诱导的血管平滑肌细胞增殖和迁移的机制研究

摘要

目前已有研究显示，体内血清中TRAIL表达水平与E2水平呈显著负相关，并且体外实验显示，给予E2处理后，可明显降低外周血单核细胞TRAIL的表达，这表明TRAIL可能是E2的调控靶点。
　　综上所述，本研究将探讨E2对VSMCs中TRAIL的表达影响，并进一步阐明E2抑制VSMCs增殖和迁移的作用机制，本文分为以下几部分。
　　第一章 E2对VSMCs中TNF-α诱导的TRAIL表达影响
　　为了探讨E2对VSMCs中TNF-α诱导的TRAIL表达影响，笔者分别采用ELISA和实时荧光定量PCR方法检测TRAIL蛋白和mRNA表达水平，并用MTT法和细胞划痕实验观察E2对TNF-α诱导的VSMCs增殖和迁移的影响。
　　1.1 TNF-α通过TRAIL促进VSMCs增殖和迁移
　　笔者用不同浓度的TNF-α(1ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml)处理大鼠的VSMCs24h，分别用ELISA和实时荧光定量PCR方法检测培养液与细胞裂解液中TRAIL蛋白表达浓度以及VSMCs中TRAIL mRNA表达水平。结果显示，TRAIL蛋白表达，与对照组比较，当TNF-α浓度大于等于10 ng/ml时可明显增加VSMCs中的TRAIL表达，增长率分别为(56.6±7.8)％、（80.9±9.2）％、(119.1±11.3)％(n=5,*p＜0.01 vs.CON;**p＜0.001 vs.CON); TRAILmRNA表达水平与对照组比较，同样在TNF-α处理浓度大于等于10 ng/ml时可明显增加TRAIL mRNA表达，增长率分别为(110±10.9)％、（180±13.1）％、(220±13.2)％，（n=5，**p＜0.01 vs.CON）。
　　1.2 E2呈浓度依赖性抑制TNF-α诱导的TRAIL表达
　　为了观察E2对TNF-α诱导的TRAIL表达的影响，笔者用模拟生理浓度的E2（10-9M、10-8M、10-7M、10-6M）预处理大鼠VSMCs24h，再用TNF-α(100ng/ml)处理24h，分别用ELISA和实时荧光定量PCR方法检测培养液与细胞裂解液中TRAIL的蛋白表达水平以及VSMCs中TRAIL mRNA表达水平。
　　小结:TNF-α可增加VSMCs中TRAIL表达，从而促进VSMCs增殖和迁移，此作用可被E2抑制，并由ERα所介导。
　　第二章 E2通过抑制NF-κB通路抑制TRAIL表达
　　为了探讨E2抑制TRAIL表达上调的作用机制，笔者用不同的蛋白酶抑制剂筛选出参与此效应的信号通路，并用Western blot方法及活性检测试剂盒观察E2对此通路的调节作用。
　　2.1 TNF-α通过NF-κB上调TRML表达
　　笔者用不同信号通路抑制剂:NF-κB抑制剂PDTC（20μM）、p38抑制剂ML3403（50μM）、JNK抑制剂IQ1S（20μM）、MEK抑制剂PD98059（5μM）和ERK1/2抑制剂FR180204(20μM)）提前处理VSMCs24 h后，再用TNF-α继续处理24 h，分别用ELISA和实时荧光定量PCR方法检测TRAIL蛋白和mRNA表达情况。结果发现，TNF-α可明显促进TRAIL蛋白和mRNA表达，而只有NF-κB抑制剂PDTC处理组TRAIL蛋白和mRNA表达受到抑制，其中蛋白表达抑制率为（44.4±3.3）％，mRNA抑制率为（59.1±5.6）％(n=5，*p＜0.01 vs.CON;#p＜0.01 vs.TNF-α)。说明TNF-α促进TRAIL蛋白和mRNA表达是由NF-κB信号通路介导的，而与MAPK信号通路无关。
　　2.2 E2抑制TNF-α诱导的NF-κB p65磷酸化和转位
　　用10-8M浓度的E2预处理大鼠VSMCs24 h，再用TNF-α(100 ng/ml)处理15 min，用Western blot方法分别检测细胞内p65磷酸化水平，胞浆p65以及胞核内p65蛋白表达水平。结果显示，TNF-α可明显提高p65蛋白磷酸化水平，增加率为（773.0±13.9）％，同时可增加细胞核内p65蛋白表达，增加率为（698.6±19.7）％，即促进p65从细胞质向细胞核转移;用E2预处理的实验组，p65磷酸化水平降低，与单纯的TNF-α处理组比较，抑制率为（89.8±12.9）％，同时还可抑制p65向细胞核内转移，即抑制细胞核内p65蛋白水平，抑制率为(86.2±11.8)％(n=5,*p＜0.001 vs.CON;#p＜0.001 vs.TNF-α)。
　　2.3 E2抑制TNF-α诱导的IκBα磷酸化
　　用10-8M浓度的E2预处理大鼠VSMCs24 h，再用TNF-α(100 ng/ml)处理15 min，用Western blot方法分别检测细胞内磷酸化IκBα水平以及IκBα的总表达量。结果提示，TNF-α可明显提高IκBα蛋白磷酸化水平，增加率为（776.5±17.3）％，此作用可被E2抑制，抑制率为（86.2±6.2）％(n=5，*p＜0.001 vs.CON，#p＜0.001vs.TNF-α)。而TNF-α与E2对总的hκBα蛋白表达无显著影响。
　　2.4 E2抑制TNF-α诱导的IKK磷酸化及其活性
　　用10-8M浓度的E2预处理大鼠VSMCs24 h，再用TNF-α(100 ng/ml)处理15 min，用Western blot方法分别检测细胞内磷酸化的IKKα/β/γ。结果显示，TNF-α可明显提高IKKα/β/γ蛋白磷酸化水平，增加率分别为（626.8±13.6）％、(701.6±19.6)％、（539.7±16.9）％。
　　小结:E2通过抑制VSMCs中NF-κB通路，从而抑制TNF-α诱导的TRAIL表达。
　　第三章 E2通过促进NO释放抑制NF-κB通路
　　在本部分实验中，为探讨E2抑制NF-κB通路的机制，笔者检测了雌激素对于NO释放的影响以及阻断NO后对于NF-κB活性的调控作用。
　　3.1 不同浓度E2处理VSMCs促进NO释放
　　笔者用不同浓度的E2（10-9M、10-8M、10-7M、10-6M）预处理大鼠VSMCs24h，测定其对NO释放的影响。结果发现，不同浓度的E2(10-9M、10-8M、10-7M、10-6M)均能促进NO释放，其增加幅度分别为（146.4±9.3）％、(185.2±11.6)％、(165.2±12.8)％、(137.2±10.5)％(n=5,*p＜0.05 vs.CON;**p＜0.01 vs.CON)。
　　3.2 E2呈时间依赖性促进NO释放
　　笔者用10-8M浓度的E2处理大鼠VSMCs不同时间(6h、12h、24 h、48 h)后，检测培养液上清中NO的水平。结果显示，与空白对照组比较，E2处理大鼠VSMCs6 h、12h、24 h、48 h后均可促进NO释放，其增加幅度为（126.4±8.5）％、(165.2±10.4)％、（213.2±15.6)％、（180.2±12.6)％(n=5,*p＜0.05 vs.CON;**p＜0.01 vs.CON)。
　　3.3 NO供体硝普钠(SNP)抑制TNF-α促TRAIL表达的效应
　　笔者以NO供体SNP(10-4M)预处理VSMCs1 h后，用10-8M浓度的E2预处理大鼠VSMCs24 h，再用TNF-α(100 ng/ml)处理24 h，以ELISA方法检测培养液与细胞裂解液中TRAIL蛋白表达浓度。结果发现，SNP可显著抑制TNF-α诱导的TRAIL蛋白表达，其抑制率为（63.2±6.7）％(n=5，#p＜0.01 vs.TNF-α); E2(10-8M)同样可以抑制TNF-α对TRAIL蛋白的上调作用，其抑制率为（60.1±7.3）％（n=5，#p＜0.01 vs.TNF-α），这一作用与SNP作用并不叠加，表明雌激素主要通过NO途径抑制TRAIL蛋白表达。
　　3.4 NO抑制剂L-NMMA抑制E2对TRAIL表达的下调效应
　　笔者以NO抑制剂L-NMMA(10-5M)预处理VSMCs1 h后，用10-8M浓度的E2预处理大鼠VSMCs24 h，用TNF-α(100 ng/ml)处理24 h，以ELISA方法检测培养液与细胞裂解液中TRAIL蛋白表达浓度。结果发现，L-NMMA对TNF-α诱导的TRAIL蛋白表达没有影响，但其可显著抑制E2(10-8M)对TRAIL蛋白的下调作用，其抑制率为（58.2±8.8）％（n=5，*p＜0.01 vs.CON）。
　　小结:E2通过促进NO释放，抑制VSMCs中NF-κB通路，从而抑制TNF-α诱导的TRAIL蛋白表达。
　　结论:
　　1.TNF-α诱导VSMCs内TRAIL表达，并促进VSMCs增殖和迁移;
　　2.E2可抑制VSMCs中TNF-α诱导内TRAIL表达，并抑制VSMCs增殖和迁移;
　　3.E2通过促进NO释放，抑制VSMCs中NF-κB通路，从而抑制TNF-α诱导的TRAIL表达以及VSMCs的增殖和迁移。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 E2对VSMCs中TNF-α诱导的TRAIL表达影响

1．1 引言

1．2 材料和方法

1．3 结果

1．4 讨论

1．5 小结

参考文献

第二章 E2通过抑制NF-κB通路抑制TRAIL表达

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 小结

参考文献

第三章 E2通过促进NO释放抑制NF-κB通路

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 小结

参考文献

结论

论文不足之处

缩略词简表

综述 TRAIL在血管炎症及动脉粥样硬化中的研究进展

博士研究生期间发表论文及成果

致谢

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