基于中医异病同证理论探讨轮状病毒与HBGA的相关性研究

摘要

病毒性胃肠炎又称病毒性腹泻，是一组由多种病毒引起的急性肠道传染病。目前研究表明轮状病毒(Rotavirus，RV)、诺如病毒(Norovirus，NoV)是急性病毒性胃肠炎的最主要的两种病原体，占到所有病原体的60％以上。尽管各种病原体的基因组结构不尽相同，但它们所致胃肠炎的临床表现基本类似，主要表现为:起病急、恶心、呕吐、腹痛、腹泻，排水样便或稀便，也可有发热及全身不适等症状。
　　因为RV和NoV是两种不同的病原体，现代医学通常将RV和NoV胃肠炎分属为两种不同的疾病进行论述。由于两者都具有呕吐、腹泻、发热等相同的临床症状和体征，RV和NoV胃肠炎应同属中医“泄泻”范畴，其病因病机之关键在于脾虚湿盛。证，是机体在疾病发展过程中的某一阶段的病理概括，亦机体对病因作用的整体反应状态，反应了疾病发展过程中某一阶段病理变化的本质。既然RV和NoV胃肠炎具有相同（或相似）的证，那么，RV与NoV感染是否存在着“异病同证”的物质基础呢？从组成人体的物质分子方面分析引起证的物质基础时，中医证的本质是一类具有信使分子性能的蛋白质和肽类分子。从病毒感染人体的发病机制而言，细胞表面的特异性受体是病毒感染宿主细胞的决定因素之一。基于此，本课题提出:RV和NoV胃肠炎“异病同证”的物质基础可能与相似的受体或共受体有关，即两种病毒存在相同的受体或共受体。
　　由于NoV不能体外培养，亦无小动物模型，经过近十余年来的志愿者攻击试验、分子流行病学和分子生物学实验研究，现已基本确认肠道黏膜上的人类组织血型抗原(human histo-blood group antigens，HBGA)是NoV的病毒受体。HBGA是红细胞、呼吸道、泌尿生殖道和消化道粘膜上皮细胞表面的一类复杂的碳水化合物（以低聚糖、糖脂或者糖蛋白的形式存在），也可以自由寡聚糖的形式分泌在唾液、血液、母乳和肠道等体液中。在肠道上皮细胞上表现为ABH和Lewis抗原，对应在红细胞上表现为分泌型（A、B、O血型）和非分泌型。HBGA受体的发现成为NoV研究的里程碑，极大地推进了NoV与人类宿主相互作用关系、病毒进化及免疫学机制等方面的研究。目前，RV的受体研究主要集中在细胞功能性蛋白上，初步认为Toll样受体、整合素家族、神经节苷脂、热应激同源蛋白(Hsc70)等都有一定的作用。近期有研究表明，RV感染与HBGA受体存在相关性。
　　本课题组在RV感染可能与HBGA相关的研究基础上，提出“RV和NoV胃肠炎异病同证的物质基础可能与相似的受体或共受体有关”。首先，我们运用分子流行病学方法，收集临床腹泻患者的粪便标本和配对唾液，以RV阴性和健康人群为对照，分析比较RV感染和HBGA相关性。同时，运用分子生物学实验方法表达RV的衣壳蛋白VP8*，进行体外RV-VP8*与唾液HBGA的结合方式研究。
　　（一）轮状病毒感染与HGBA相关性的流行病学研究
　　2013-2014年间在南方医院儿科门诊收集病毒性腹泻患者粪便及配对唾液样本，并以广州某小学的健康人群唾液作为对照。粪便样本通过trizol法行RNA提取，经逆转录后以cDNA为模板，行PCR扩增RV-VP4区域以及NoVGⅠ型GⅡ型片段。RV阳性样本进一步用分型引物进行分型，不能用分型引物分型者经公司测序后结合NCBI BLAST功能以确定其基因型别。配对唾液的HBGA表型鉴定用ELISA方法，检测的单抗包括A、B、H、Lewis a、Lewis b、Lewisx、Lewisy。其中，Lea-b+和/或Lex-y+为分泌型，Lea+b+和/或Le x+y+为部分分泌型，二者均归入分泌型;Lea+b-和/或Lex+y-为非分泌型。南方医院配对样本共266份，RV阳性样本75份，配对唾液样本中，检出A型22份，B型17份，O型33份，AB型3份;Lea-b+/Lex-y+63份，Lea+b+/Lex+y+12份，Lea+b-/Lex+y-0份，分泌型75份，非分泌型0份。阴性样本191份，剔除NoV阳性样本40例后总样本151份，检出A型47份，B型44份，O型50份，AB型10份;Lewis状态结果Lea-b+/Lex-y+132份，Lea+b+/Lex+y+9份，Lea+b-/Lex+y-10份;分泌型141份，非分泌型10份。用SPSS20.0统计软件，统计方法用x2检验，RV阳性与阴性之间的血型差异Pearson x2=3.047，自由度=3，P值=0.384(P＞0.05)，即RV阴阳性之间的血型差异没有统计学意义。Lewis状态用Fisher精确检验，x2=10.659，自由度=2，P值=0.004(P＜0.05)，Lewis状态在RV感染与否中有显著性差异，即Lewis状态对RV感染与否有影响。分泌型在RV感染与否中，P值=0.033(P＜0.05)，数据显示分泌型在腹泻患者中对RV感染与否有显著性差异，RV感染与HBGA分泌型有关。
　　通过对健康人群159份唾液进行HBGA表型分析，结果表明，A型为35份，B型39份，O型79份，AB型6份; Lea-b+/Lex-y+134份，Lea+b+/Lex+y+5份，Lea+b-/Lex+y-20份;即分泌型139份(87.4％)，非分泌型20份(12.6％)。RV阳性样本HBGA状态如前所述。用SPSS20.0统计软件对RV阳性和健康对照进行两组间的x2检验，结果发现两组间的ABO血型差异Pearson卡方=1.546，P值=0.672(P＞0.05)，没有统计学意义;两组间的Lewis状态经Fisher精确检验，P值=0.000(P＜0.05)，存在显著性差异。分泌型状态经Fisher精确检验，P=0.001(P＜0.05)，亦存在显著性差异。结果充分表明:RV感染虽然与患者的ABO血型状态没有明显相关，但是与患者的分泌型状态存在明显的相关性，RV只感染分泌型患者，而不感染非分泌型患者。
　　（二）轮状病毒VP8*与唾液HBGA的结合方式研究
　　随机选取选取3份轮状病毒P[8]和3份P[4]阳性样本，经one-step RT-PCR试剂盒扩增VP4区域后，再行高保真酶扩增VP8*，将目的基因VP8*插入Pjet-2载体后，连接产物转入top10后行质粒提取。重组质粒与pGEX-4T-1载体经BamHⅠ、SalⅠ双酶切后切胶回收纯化，线性载体pGEX-4T-1与目的片段VP8*连接后转化到感受态细胞top10，经菌落PCR或者菌落摇菌后质粒提取行BamHⅠ和 SalⅠ双酶切鉴定。对正确插入目的片段的质粒pGEX-4T-1-VP8*再次转化入感受态细胞BL21，通过挑选菌落摇菌、扩大培养、离心、重悬、超声破菌、离心以及与GST亲和柱吸附等步骤进行蛋白表达。最后成功表达P[8]（GZ023株）和P[4](GZ705)株样本GST-VP8*蛋白。经对洗脱蛋白进行SDS-PAGE分析，证实成功获取所需的GST-VP8*融合蛋白。为后续研究VP8*与HBGA的结合模式奠定了实验基础。
　　轮状病毒VP8*与唾液HBGA的结合方式采用ELISA法进行检测。选取84份配体唾液进行体外结合实验，其中分泌型A型22份、B型17份、O型33份，AB型3份，非分泌型(N)9份。根据梯度实验结果，选取RV P[8]、P[4]GST-VP8*蛋白10μg/ml为最佳反应浓度。实验结果表明:P[8] GST-VP8*结合分泌型HBGA的OD均值分别为A=1.082，B=0.486，AB=0.590，O=1.151，即其与HBGA的结合能力为O＞A＞AB＞B，而与非分泌型不结合。与其相类似，P[4]GST-VP8*结合分泌型HBGA的OD均值分别为A=0.348，B=0.157，AB=0.186，O=0.334，即其与HBGA结合能力为A＞O＞AB＞B，同样的表现为与非分泌型不结合。就两者而言，RV P[8]较P[4]GST-VP8*蛋白结合HBGA能力强。该结果进一步阐明了RV感染与HBGA结合模式。P[8]、P[4]均能结合分泌型人群，且P[8]具有更强结合能力（分泌型人群占总人群80％以上），这很好地解释P[8]和P[4]能成为RV的主要流行株，而P[8]最为流行的原因。
　　综合以上研究结果，我们首次在中国临床人群中证实轮状病毒感染与HBGA分泌型显著相关，并通过建立体外RV GST-VP8*/HBGA结合模型，证实P[8]和P[4]均只结合HBGA分泌型，而与非分泌型不结合。该结果初步证明了我们提出的RV和NoV胃肠炎异病同证的物质基础可能与HBGA相关的理论假说，为今后开展中医异病同证的证本质研究提供示范作用，还为HBGA作为RV的受体研究指明了方向。

目录

摘要

第一章 前言

1 病毒性胃肠炎主要病原体的研究概况

2 轮状病毒和诺如病毒“异病同证”的共同受体基础研究设想

3 轮状病毒和诺如病毒的受体研究现状

4 HBGA受体的发现

5 论文的研究目的和方法

第二章 轮状病毒胃肠炎与HGBA相关性的流行病学研究

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第三章 轮状病毒主要流行株P[8]、P[4]重组GST-VP8*蛋白的表达

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第四章 重组GST-VP8*蛋白与唾液HBGA的结合方式研究

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

全文小结

参考文献

中英文缩略词表

综述 HBGAs-RV和NoV共同的一个生态位

攻读学位期间成果

致谢

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