T3对钙磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化的影响及其分子机制

摘要

目的：
　　本文拟通过钙化模型在细胞水平研究三碘甲腺原氨酸(3，5，3'-Triiodothyronine，T3)在血管钙化及血管平滑肌细胞(VSMCs)向成骨样细胞表型转化时相关蛋白及转录因子的变化和作用，并进一步明确T3调节血管钙化及VSMCs向成骨样细胞表型转化的主要信导转导通路，从而论证T3是抑制血管钙化的重要内源性保护物质，为临床调节和逆转血管钙化所致的动脉高压相关疾病提供有效的实验基础。
　　方法：
　　体外培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞A7r5，将细胞随机分为正常对照组、钙化模型组（加入β-甘油磷酸盐和氯化钙培养基）、T3干预组（在钙磷培养基中加入T3，根据浓度再分为10-7、10-8、10-9mol/L三个亚组）和抑制剂干预组，对细胞采用茜素红染色检测钙化结节，细胞骨钙素含量测定，ALP活性检测，RT-PCR检测Runx2和Osterix的mRNA含量，Western blot检测骨化指标OPN、SM22α-actin和SMα-actin及信号通路调节蛋白ERK1/2、P-ERK、Akt、P-Akt的表达水平，加入信号通路抑制剂后再次检测Runx2和Osterix的mRNA含量以及OPN、SM22α-actin和SMα-actin的蛋白含量。
　　结果：
　　与正常对照组相比，钙化组A7r5细胞的骨钙素含量、ALP活性、Osterix和Runx2mRNA水平、OPN蛋白水平均显著升高(P＜0.01)，SMα和SM22α蛋白水平显著下降（P＜0.01）;加入T3干预后细胞骨钙素含量、ALP活性明显降低，Osterix和Runx2mRNA、OPN蛋白表达明显下调，而加入MMI后可阻断以上T3的抑制效果;与钙化组相比，抑制剂组Osterix和Runx2mRNA、OPN蛋白表达显著升高(P＜0.01)。钙化组可检测到信号通路调节蛋白ERK1/2、P-ERK、Akt、P-Akt的表达增加，加入整合素αvβ3/ERK阻断剂(PD98059)、PI3K/Akt拮抗剂(LY294002)后，再用T3进行干预，抑制钙化的效果依然存在，但与单纯加抑制剂组相比无统计学差异，两组间比较提示LY294002的抑制效果较PD98059明显(P＜0.01)。
　　结论：
　　1、钙磷培养液诱导A7r5细胞12天可成功构建钙化细胞模型。
　　2、T3可降低A7r5钙化细胞的钙沉积及碱性磷酸酶活性，此效应呈浓度依赖性，说明T3是调节血管钙化的内源性保护物质。
　　3、T3上调平滑肌细胞标志分子SM22α和SMα，使骨相关蛋白OPN的表达增加，同时检测到骨分化的重要转录因子Runx2和Osterix的mRNA水平下降，而加入T3拮抗剂MMI后，上述T3抑制钙化的效果被部分拮抗，说明T3通过抑制血管平滑肌细胞表型转化这一关键环节来调节血管钙化。
　　4、钙磷诱导A7r5细胞钙化过程中可检测到信号通路调节蛋白ERK1/2、Akt的活化，加入相应的抑制剂后表型转化特异性转录因子Osterix和Runx2mRNA的表达均有所下调，随着抑制剂浓度的升高骨分化蛋白OPN的蛋白水平逐渐下降，收缩表型标志物SMα和SM22α的蛋白水平逐渐恢复，利用筛选出的抑制剂浓度加入钙化液后再用T3进行干预，结果表明LY294002的抑制效果较PD98059明显，提示钙磷诱导的A7r5细胞钙化可能与PI3K/Akt信号通路的激活有更明显的关系。

目录

摘要

前言

参考文献

第一部分 T3对大鼠血管平滑肌细胞钙化模型的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二部分 外源性T3对血管平滑肌细胞表型转化标志物的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三部分 T3抑制血管平滑肌细胞表型转化相关信号通路的调节

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文总结

综述 血管钙化及其平滑肌细胞表型转化的调节机制

中英文缩略词表

攻读学位期间成果

致谢

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