FK866通过c-jun-氨基末端激酶(JNK)依赖的自噬减轻急性肝衰竭的机制

摘要

研究目的：
　　有报道称磷酸核糖转移酶特异性小分子抑制剂FK866能够减轻小鼠急性肝衰竭，然而，FK866发挥肝脏保护作用的机制尚不清楚。有文献表明，自噬对急性肝损伤具有保护作用，但是FK866发挥作用的机制是否与自噬有关及其相关调节通路仍不明确。C-jun氨基末端激酶作为丝裂酶原活化蛋白激酶家族中的重要成员之一，曾被表明在肝衰竭的发生中起着关键作用，而且被报道对自噬起着较强的反向调节作用。故本研究的目的是探讨D-半乳糖胺/脂多糖和刀豆蛋白A所导致的急性肝衰竭中，自噬参与FK866减轻肝脏损伤的机制及其与c-jun氨基末端激酶间的密切联系。
　　研究方法：
　　首先在体内实验中，以8周雄性C57BL/6小鼠作为研究对象，构建D-半乳糖胺/脂多糖、刀豆蛋白A两种急性肝衰竭小鼠模型。对两种急性肝衰竭小鼠模型进行FK866预处理，通过检测小鼠血清中的转氨酶水平和苏木精-伊红染色进行肝组织学分析以及采用聚合酶链式反应检测小鼠肝组织中炎症因子的基因水平，探讨FK866对小鼠急性肝衰竭的作用;通过蛋白质印迹方法检测自噬标志物的蛋白表达水平，考察FK866对小鼠肝组织中自噬的影响。采用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤和自噬诱导剂雷帕霉素对两种急性肝衰竭小鼠进行干预处理探讨自噬是否参与FK866保护肝损伤的机制，并且选择JNK抑制剂SP600125对两种急性肝衰竭小鼠进行干预处理来探讨JNK在自噬进程中的作用。其次，在体外实验中，分离并培养C57BL/6小鼠原代肝细胞，对原代肝细胞进行D-半乳糖胺/脂多糖刺激，并给予以上动物实验中采用的处理，此外，尚运用了Atg7和Jnk特异性小干扰RNA，分别对Atg7和Jnk基因进行干扰，并通过可以表达红绿双荧光融合蛋白的腺病毒感染细胞来观察自噬体和自噬溶酶体的形成进一步分析自噬流的强弱，通过检测原代肝细胞中的乳酸脱氢酶释放量来评估各处理组中的肝毒性强弱。
　　研究结果：
　　在D-半乳糖胺/脂多糖和刀豆蛋白A诱导的两种急性肝衰竭小鼠模型以及D-半乳糖胺/脂多糖刺激的小鼠原代肝细胞中，FK866均能发挥保护作用，并且能够增强自噬，抑制JNK的活性;雷帕霉素诱导自噬可以减轻急性肝衰竭;3-甲基腺嘌呤或Atg7特异性小干扰RNA抑制自噬可以削弱FK866对肝细胞损伤的保护作用;而且SP600125或Jnk特异性小干扰RNA抑制JNK能够活化自噬和减轻肝毒性。
　　研究结论：
　　在D-半乳糖胺/脂多糖和刀豆蛋白A诱导的两种急性肝衰竭小鼠模型以及D-半乳糖胺/脂多糖刺激的小鼠原代肝细胞中，FK866能通过抑制JNK通路上调自噬进而发挥肝脏保护功能。FK866可作为一种简单适用的药物保护肝损伤，自噬和JNK也可为急性肝衰竭的治疗提供有效的作用靶点。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 急性肝衰竭的研究概况

1．2 FK866的简介及其在疾病治疗中的作用

1．3 自噬的研究进展

1．3．1 自噬的概述

1．3．2 自噬在肝脏疾病中的重要作用

1．3．3 自噬与FK866的关联

1．4 JNK的研究概况

1．4．2 JNK与自噬间的作用机制简述

1．5 立题依据与研究目的

第二章 小鼠急性肝衰竭模型构建

2．1 引言

2．2 实验材料与方法

2．2．1 实验动物

2．2．2 主要仪器及试剂

2．2．3 实验方法

2．3 实验结果

2．3．1 小鼠的一般情况

2．3．2 小鼠血清的转氨酶水平测定

2．3．3 小鼠的肝组织学检测

2．4 讨论与结论

第三章 FK866在小鼠急性肝衰竭模型中的作用研究

3．1 引言

3．2 实验材料与方法

3．2．1 实验动物

3．2．2 主要仪器及试剂

3．2．3 实验方法

3．3 实验结果

3．3．1 两种模型中NAMPT免疫组化染色检测

3．3．2 考察不同处理时小鼠肝组织中NAMPT的蛋白表达水平

3．3．3 FK866预处理对急性肝衰竭小鼠一般情况的影响

3．3．4 FK866预处理对急性肝衰竭小鼠血清中转氨酶水平的影响

3．3．5 FK866预处理对急性肝衰竭小鼠肝组织学的影响

3．3．6 FK866预处理对小鼠肝组织中炎症因子水平的影响

3．4 讨论与结论

第四章 小鼠急性肝衰竭模型中FK866对自噬的影响研究

4．1 引言

4．2 实验材料与方法

4．2．1 实验动物

4．3．2 验证FK866对急性肝衰竭小鼠肝组织中自噬的影响

4．2．3 实验方法

4．3 实验结果

4．3．1 FK866对急性肝衰竭小鼠肝组织中自噬标志物蛋白表达水平的影响

4．3．2 验证FK866对急性肝衰竭小鼠肝组织中自噬的影响

4．4 讨论与结论

第五章 小鼠急性肝衰竭模型中FK866通过自噬发挥肝脏保护作用的验证

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 实验动物

5．2．2 主要仪器与试剂

5．2．3 实验方法

5．3 实验结果

5．3．1 3MA干预对小鼠肝组织中自噬标志物蛋白表达水平的影响

5．3．2 3MA干预对急性肝衰竭小鼠一般情况的影响

5．3．3 3MA干预对急性肝衰竭小鼠血清中转氨酶水平的影响

5．3．4 3MA处理对急性肝衰竭小鼠肝组织学的影响

5．3．5 雷帕霉素对急性肝衰竭小鼠肝组织中自噬的影响

5．3．6 雷帕霉素干预对急性肝衰竭小鼠生存率的影响

5．3．7 雷帕霉素对急性肝衰竭小鼠血清中转氨酶水平的影响

5．3．8 雷帕霉素对急性肝衰竭小鼠肝组织学的影响

5．4 讨论与结论

第六章 小鼠急性肝衰竭模型中JNK参与FK866作用机制的研究

6．1 引言

6．2 材料与方法

6．2．1 实验动物

6．2．2 主要仪器与试剂

6．2．3 实验方法

6．3．1 FK866预处理对急性肝衰竭小鼠肝组织中JNK蛋白表达水平的影响

6．3．2 SP600125干预对急性肝衰竭小鼠肝组织中自噬的影响

6．3．3 SP600125预处理对急性肝衰竭小鼠生存率的影响

6．3．4 SP600125对急性肝衰竭小鼠血清中转氨酶水平的影响

6．3．5 SP600125预处理对小鼠肝组织学的影响

6．4 讨论与结论

第七章 FK866在原代肝细胞中的作用研究

7．1 引言

7．2 材料与方法

7．2．1 分离原代肝细胞所用动物

7．2．2 主要仪器及试剂

7．2．3 实验方法

7．3．1 考察FK866预处理对原代肝细胞中NAMPT的蛋白表达水平的影响

7．3．2 FK866预处理后原代肝细胞中LDH毒性检测

7．3．3 FK866对原代肝细胞中自噬标志物蛋白表达水平的影响

7．3．4 FK866对原代肝细胞中自噬流的影响

7．3．5 验证FK866对原代肝细胞中自噬的影响

7．4 讨论与结论

第八章 原代肝细胞中FK866通过自噬发挥作用的验证

8．1 引言

8．2 实验材料与方法

8．2．1 分离原代肝细胞所用动物

8．2．2 主要仪器及试剂

8．2．3 实验方法

8．3 实验结果

8．3．1 3MA干预对原代肝细胞中自噬标志物蛋白表达水平的影响

8．3．2 3MA的干预对原代肝细胞中自噬流的影响

8．3．3 3MA干预后原代肝细胞中LDH毒性检测

8．3．4 Atg7干扰模型的验证

8．3．5 检测转染Atg7 siRNA对原代肝细胞中自噬流的影响

8．3．6 Atg7 siRNA转染后原代肝细胞LDH毒性检测

8．3．7 雷帕霉素对原代肝细胞中自噬标志物蛋白表达水平的影响

8．3．8 雷帕霉素对原代肝细胞中自噬流的影响

8．3．9 雷帕霉素预处理后原代肝细胞中LDH毒性检测

8．4 讨论与结论

第九章 原代肝细胞中JNK参与FK866作用机制的研究

9．1 引言

9．2 材料与方法

9．2．1 分离原代肝细胞所用动物

9．2．2 主要仪器及试剂

9．2．3 实验方法

9．3．1 FK866预处理对原代肝细胞中中JNK蛋白表达水平的影响

9．3．2 SP600125干预对原代肝细胞中自噬的影响

9．3．3 SP600125预处理对原代肝细胞中自噬流的影响

9．3．4 SP600125预处理后原代肝细胞中LDH毒性检测

9．3．5 Jnk干扰模型的验证

9．3．6 检测转染Jnk siRNA对原代肝细胞中自噬的影响

9．3．7 JnksiRNA转染后原代肝细胞中LDH毒性检测

9．4 讨论与结论

第十章 结论与展望

参考文献

英文缩略词对照表

攻读学位期间的成果

致谢

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