曲美他嗪促进AMPK依赖的自噬流减轻心肌细胞缺氧复氧损伤

摘要

研究目的:
　　观察曲美他嗪(Trimetazidine，TMZ)预处理能否有效减轻心肌细胞缺氧/复氧(Hypoxia/reoxygenation，H/R)损伤，并探索心肌细胞缺氧/复氧期间，曲美他嗪预处理是否经过单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)通路调控自噬。
　　研究方法:
　　第一部分实验:观察H/R过程中曲美他嗪的保护作用，并确定最有效浓度。
　　构建新生大鼠心肌细胞H/R模型，研究对象随机分为对照组、H/R组、H/R+TMZ（10μM）组、H/R+TMZ(50μM)组、H/R+TMZ(100μM)组。采用MTS检测细胞活性，收集培养液并通过试剂盒检测LDH水平以观察细胞损伤程度，比较各浓度疗效，确定最有效浓度。
　　第二部分实验:探明曲美他嗪对H/R过程中自噬的影响及干预自噬表达对曲美他嗪疗效影响
　　本部分实验主要采用氯喹(chloroquine，Cq)抑制自噬流，实验分组为对照组、对照+TMZ组、对照+Cq组、H/R组、H/R+TMZ组、H/R+Cq组、H/R+TMZ+Cq组。MTS检测细胞活性，试剂盒检测培养液LDH水平，并通过Western blot半定量分析自噬相关蛋白Beclin-1、LC3和p62的表达，转染病毒mRFP-GFP-LC3并通过共聚焦显微镜以测定细胞自噬相关蛋白分布情况，透射电镜直接观察各组自噬体数量，TUNEL染色检测心肌细胞凋亡水平。
　　第三部分实验:探明H/R过程中干预AMPK对曲美他嗪所调控的自噬的影响
　　本部分实验主要使用compound C(com C)抑制AMPK信号，实验分组为对照组、对照+ com C组、H/R组、H/R+TMZ组、H/R+com C组、H/R+TMZ+ comC组。MTS检测细胞活性，试剂盒检测培养液LDH水平，最后通过Western blot半定量分析自噬相关蛋白LC3和p62及AMPK信号通路蛋白p-AMPK/AMPK和p-mTOR/mTOR的表达。
　　研究结果:
　　1.曲美他嗪预处理减轻心肌细胞H/R损伤
　　与对照组相比，H/R组的细胞活性显著性下降(P＜0.05);各曲美他嗪预处理组细胞活性均比H/R组高(P＜0.05)，H/R+TMZ(50μM)组细胞活性比H/R+TMZ(10μM)组高(P＜0.05)，但与H/R+TMZ(100μM)组无统计学差异(P＞0.05)。因此50μM为曲美他嗪的最有效浓度。
　　2.曲美他嗪预处理在心肌细胞H/R期间促进自噬流
　　H/R处理后各自噬相关蛋白均表达上调（P＜0.05，C vs.H/R组），然而曲美他嗪预处理后Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均进一步增强，p62减少(P＜0.05，H/Rvs.H/R+ TMZ组);透射电镜结果显示，相比对照组，HR组细胞浆内出现更多自噬体，(P＜0.05);而相比H/R组，H/R+TMZ组自噬体数量进一步增加(P＜0.05)。共聚焦显微镜下，对照组无明显LC3聚集现象;H/R处理后，自噬体数量明显增加(P＜0.05，Cvs.H/R组);与H/R组相比，H/R+TMZ组的自噬溶酶体更多(P＜0.05)。
　　3.Cq预处理抵消曲美他嗪对心肌细胞的保护作用
　　Cq预处理后，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62的表达均增加(P＜0.05，H/R+ TMZ vs.H/R+TMZ+Cq组);共聚焦显微镜下，Cq预处理显著减少自噬溶酶体(P＜0.05，H/R+TMZ vs.H/R+ TMZ+ Cq组）;与H/R+TMZ组相比，H/R+TMZ+Cq组细胞活性明显下降(P＜0.05);
　　4.曲美他嗪预处理减少H/R中细胞凋亡
　　TUNEL染色结果显示，与对照组相比，H/R组凋亡细胞显著性增加(P＜0.05);曲美他嗪预处理后，凋亡细胞数量明显减少（P＜0.05，H/R vs.H/R+ TMZ组）;然而H/R+TMZ+Cq与H/R+ TMZ组相比，凋亡细胞显著性增加(P＜0.05)。
　　5.曲美他嗪预处理通过AMPK-mTOR调控H/R中的自噬
　　与H/R组相比，曲美他嗪预处理显著增加p-AMPK/AMPK的比值以及减少p-mTOR/mTOR的比值（P＜0.05，H/R vs.H/R+ TMZ组）;与H/R+ TMZ组相比，compound C减少p-AMPK/AMPK比值，增加p-mTOR/mTOR比值(P＜0.05);此外，compound C减少LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值并增加了p62的表达;H/R+TMZ+com C与H/R+ TMZ组相比，其细胞活性减少，LDH水平增加(P＜0.05)，
　　研究结论:
　　曲美他嗪预处理通过AMPK-mTOR信号通路促进自噬流减轻心肌细胞H/R损伤。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 心肌缺血再灌注损伤

1．2 自噬在心肌缺血再灌注中的作用

1．3 AMPK及对自噬的调节

1．4 曲美他嗪与AMPK信号通路

2．1 主要实验材料

2．2 原代心肌细胞的提取与培养

2．3 细胞换液与培养

2．4 心肌细胞缺氧／复氧(Hypoxia／reoxygenation，H／R)模型构建

2．5 主要实验分组

2．6 细胞活性检测(MTS)

2．7 培养液乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase，LDH)水平检测

2．8 蛋白印迹试验(Western blot)

2．9 透射电子显微镜观察心肌细胞超微结构

2．10 mRFP-GFP-LC3腺病毒转染及荧光观察自噬流

2．11 TUNEL染色

2．12 统计方法

第三章 结果

3．1 曲美他嗪预处理保护心肌细胞H／R损伤

3．2 曲美他嗪预处理在心肌细胞H／R期间诱导自噬

3．3 曲美他嗪预处理通过促进自噬保护心肌细胞H／R损伤

3．4 曲美他嗪预处理减少H／R中细胞凋亡

3．5 曲美他嗪预处理通过AMPK-mTOR调控H／R中的自噬

第四章 讨论

第五章 总结

参考文献

英文缩写词表

成果

致谢

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