miR-21靶向PDCD4影响的凋亡在造影剂所致急性肾损伤中的作用

摘要

研究背景:
　　随着介入治疗的发展和增强CT的广泛运用，造影剂所致急性肾损伤（Contrast-induced acute kidney injury，CI-AKI）目前已成为医院获得性急性肾衰竭的第三大因素。CI-AKI的发生可增加患者身心和经济负担，同时对疾病远期预后产生负面影响。目前虽采用水化、限制造影剂剂量等方法来减少肾损伤，但高危人群中发生率仍可高达50％。因此，发病机制的研究显得尤为重要。近期研究表明，细胞凋亡是肾损伤的重要发病机制且与肾功能相关。因此，深入探讨造影剂诱导肾小管上皮细胞凋亡的分子机制，寻找关键靶点，将有利于CI-AKI的防治。
　　miRNAs具有高度保守型和组织特异性，能稳定存在于体液和组织中，可通过抑制靶基因翻译或转录后表达在胚胎发育、细胞增殖分化和凋亡方面发挥多元化的调控作用。因此，miRNAs可成为基础和临床研究沟通的桥梁，在肿瘤领域中已是新型生物学标志物。近期发现，miRNAs同样可参与肾纤维化、缺血再灌注和肾毒性药物所致急性肾损伤过程。其中，miR-21在肾病中除存在差异性表达外，还同时参与调控细胞增殖、凋亡和纤维化过程，而此调控方向正是CI-AKI发生的重要部分。但不同疾病模型导致肾损伤机制不完全一致，因此miR-21表达和作用可能会有所差异。目前尚未有研究能明确miR-21在CI-AKI中的变化和调节作用。
　　程序性细胞坏死因子4（Programmed cell death4，PDCD4）是增殖细胞中可抑制蛋白转录和翻译过程的新型抑癌基因，同时也是近年来新发现的一种与细胞凋亡相关的基因。低表达水平的PDCD4可促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移，而造影剂也可诱导肾小管上皮细胞发现凋亡和增殖，因此PDCD4可能参与调控CI-AKI的发生。另外，生物信息学分析软件提示miR-21与PDCD4存在互补碱基对。因此推测在CI-AKI中，miR-21可通过靶向PDCD4影响肾小管上皮细胞的凋亡。
　　研究目的:
　　通过比较人肾小管上皮细胞（Human renal proximal tubular epithelial，HK-2）组和造影剂组中miR-21、PDCD4和凋亡指标，探讨造影剂对HK-2细胞凋亡和基因表达影响;采用荧光素酶报告，阐明miR-21对PDCD4的靶向调控;利用基因转染技术，探讨miR-21和PDCD4在该疾病模型中的作用。
　　研究方法:
　　(1)造影剂对miR-21和凋亡的影响:1.向HK-2中加入100mgI/ml、150mgI/ml和200mgI/ml碘普罗胺接触2h、2.5h和3h，观察细胞生长，检测细胞毒性和凋亡率;2.采用qRT-PCR检测miR-21和PDCD4，Western-blot检测凋亡相关蛋白和PDCD4。
　　(2)miR-21功能学研究:1.应用基因转染技术，向HK-2细胞内转染miR-21-mimics，miR-21-inhibitor和miR-21-NC，利用qRT-PCR检测miR-21和PDCD4;2.TUNEL染色观察组间细胞凋亡;3.Western-blot检测凋亡相关蛋白和PDCD4。
　　(3)miR-21对PDCD4-3'UTR的靶向调控:1.生物学软件明确miR-21与PDCD4的配对碱基;2.合成野生型和突变型PDCD4，利用荧光素酶报告明确miR-21对PDCD4的靶向调节。
　　(4)PDCD4在造影剂诱导细胞损伤中的作用:1.细胞内分别转染siRNA-PDCD4和siRNA-NC，qRT-PCR法检测PDCD4;2.Western-blot检测凋亡相关蛋白和PDCD4。
　　研究结果:
　　(1)造影剂影响HK-2细胞状态:提升造影剂浓度和接触时间，细胞毒性和凋亡数目增加;显微镜下活动度下降、体积缩小、核质浓缩、细胞间连接减少。
　　(2)造影剂诱导HK-2细胞凋亡，抑制miR-21表达:HK-2细胞接触造影剂后凋亡细胞数增多，Bcl-2蛋白量下降，Bax含量升高，miR-21呈低表达(P＜0.05)。
　　(3)上调miR-21表达降低造影剂诱导HK-2细胞凋亡:细胞转染miR-21-mimics后，凋亡减少，Bcl-2蛋白量升高，Bax含量下降;转染miR-21-inhibitor后呈相反趋势(P＜0.05);转染空白载体上述指标较前无差异(P＞0.05)。
　　(4)miR-21靶向调节PDCD4:1.miR-21与PDCD4存在互补碱基对;2.造影剂升高HK-2中PDCD4基因和蛋白含量(P＜0.05);3.上调miR-21降低PDCD4表达，下调miR-21升高其表达，两者变化趋势相反(P＜0.05);4.转染野生型-PDCD4可使荧光表达量较突变型-PDCD4显著下降(P＜0.001)。
　　(5)PDCD4影响凋亡程度:细胞成功转染siRNA-PDCD4后，PDCD4基因和蛋白含量下降，Bax表达减少，Bcl-2含量增高，与造影剂组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　研究结论:
　　造影剂诱导HK-2细胞发生凋亡，升高PDCD4含量，抑制miR-21表达。miR-21-PDCD4-凋亡在造影剂诱导HK-2细胞损伤中发挥重要作用，为分子机制研究和后续在体验证奠定基础。

目录

摘要

第一章 前言

参考文献

第二章 材料及方法

2．1 实验材料和仪器设备

2．2 常用实验溶液的配置

2．3 实验方法

2．4 统计分析

第三章 实验结果

3．1 造影剂对HK-2细胞状态的影响

3．2 造影剂诱导HK-2细胞凋亡，抑制miR-21表达

3．3 上调miR-21的表达可降低造影剂引起的HK-2细胞凋亡

3．4 miR-21对PDCD4的靶向调控

3．5 PDCD4在造影剂诱导HK-2细胞凋亡中的作用

第四章 讨论

参考文献

第五章 结论

缩写词列表

攻读研究生期间成果

致谢

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