蓝萼甲素对人膀胱癌细胞的抗肿瘤作用及机制研究

摘要

目的：
　　本研究旨在探讨蓝萼甲素在人膀胱癌细胞的抗肿瘤作用及具体机制，从而为开发靶向PI3K/Akt通路治疗膀胱癌的药物提供新思路。
　　方法：
　　1.研究蓝萼甲素对人膀胱癌细胞增殖的抑制作用
　　1.1.通过CCK-8法检测蓝萼甲素对人膀胱癌细胞体外增殖的影响;
　　1.2.平板克隆实验检测蓝萼甲素对UMUC3细胞集落形成能力的影响;
　　2.蓝萼甲素对膀胱癌细胞UMUC3抗肿瘤作用的机制探讨
　　2.1.用流式细胞术(FCM)检测经蓝萼甲素处理后UMUC3细胞周期的变化;
　　2.2.用AnnexinV/PI双染法检测蓝萼甲素诱导UMUC3细胞凋亡的发生;
　　2.3.Western Blot方法分析周期、凋亡及PI3K/Akt通路相关蛋白的变化，从而验证蓝萼甲素是否通过PI3K/Akt通路诱导UMUC3细胞凋亡和G2/M周期阻滞;
　　2.4.用细胞免疫荧光进一步证实蓝萼甲素作用于UMUC3细胞后PI3K/Akt通路中p-Akt和Cleaved Caspase-3的细胞定位及表达量变化;
　　3.蓝萼甲素对小鼠模型UMUC3移植瘤的影响及机制研究
　　3.1.皮下成瘤实验验证在体内水平下UMUC3细胞的成瘤能力以及蓝萼甲素对NOD/SCID小鼠模型UMUC3肿瘤的影响;
　　3.2.用免疫组化实验检测蓝萼甲素对皮下瘤组织中细胞增殖活性指标Ki-67和微血管密度指标CD31的影响。
　　结果：
　　1.蓝萼甲素抑制人膀胱癌细胞的增殖和克隆形成
　　1.1.10μM蓝萼甲素对人膀胱癌细胞UMUC3、HT1197、T24和J82的增殖有明显的抑制作用，但对人膀胱永生化细胞SV-HUC-1细胞的增殖没有明显抑制作用。不同浓度蓝萼甲素(0、2.5、5、10或40μM)呈时间和剂量依赖性的抑制UMUC3细胞的活力，处理24、48、72和96小时后IC50值分别为18.87、9.77、6.75、5.40μM。
　　1.2.与对照组相比，蓝萼甲素对UMUC3细胞集落形成的数量和大小呈现浓度依赖的明显抑制作用。
　　2.蓝萼甲素可以使UMUC3细胞生长阻滞在G2/M期
　　2.1细胞流式结果分析，随着蓝萼甲素浓度的升高，更多的细胞停滞在G2/M期，更少的细胞停滞在G0/G1期，而S期变化则没有统计学差异，这表明蓝萼甲素可引起UMUC3细胞阻滞在G2/M期。
　　2.2.免疫印迹法提示蓝萼甲素可引起p21WAF1/CIP1蛋白表达水平上调，但同时下调了CyclinB1、CDK1和Cdc25C蛋白表达水平。
　　3.蓝萼甲素诱导UMUC3细胞线粒体途径介导的凋亡
　　3.1.不同浓度蓝萼甲素处理UMUC3细胞24小时后细胞凋亡率分别为(10.16±1.10)％、（29.99±8.55）％和（53.61±5.11）％，但对照组的的细胞凋亡率仅为(4.37±1.17)％。
　　3.2.免疫印迹法分析表明，与对照组相比，蓝萼甲素实验组细胞的Bax蛋白表达水平增加，但Bcl-2蛋白表达水平降低，导致Bax/Bcl-2比值随着蓝萼甲素浓度升高而上调。此外，蓝萼甲素作用于UMUC3细胞后Caspase-9、Caspase-3、PARP蛋白表达水平下降，与之相应的是有明显的Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白的累积变化。
　　3.3.免疫荧光染色显示，蓝萼甲素处理后胞浆和胞核Cleaved Caspase-3的表达量均明显增加。
　　4.蓝萼甲素抑制UMUC3细胞的PI3K/Akt信号通路
　　4.1.蓝萼甲素显著降低PI3K p85的表达水平和减少了Akt Ser473位点的磷酸化水平。但PTEN水平则随着蓝萼甲素药物浓度升高而上调，而总Akt的表达量无显著性差异。
　　4.2.细胞免疫荧光实验也证实了p-Akt(Ser473)蛋白在细胞质和细胞核的表达均有降低趋势。
　　5.通过体内实验证明蓝萼甲素对UMUC3细胞的抗肿瘤作用
　　5.1.为了评价蓝萼甲素在体内的抗肿瘤作用，我们成功建立了UMUC3皮下移植瘤的NOD/SCID小鼠模型。
　　5.2.用蓝萼甲素(20mg/kg)处理的小鼠皮下移植瘤体积明显小于对照组的肿瘤体积。对照组的肿瘤平均重量为（3.73±0.68）g，而蓝萼甲素组的肿瘤平均重量为（1.71±0.42）g。
　　5.3.在组织学水平上，我们分别选择了Ki-67和CD31这两个指标来评价蓝萼甲素对细胞增殖和微血管密度的影响。蓝萼甲素均可明显抑制移植瘤组织中Ki-67和CD31的表达水平。
　　结论：
　　1.蓝萼甲素抑制人膀胱癌细胞的增殖，呈时间和剂量依赖性。
　　2.蓝萼甲素通过Cdc25C/Cyclin B1/CDK1通路引起UMUC3细胞周期阻滞在G2/M期。
　　3.蓝萼甲素通过线粒体途径诱导UMUC3细胞凋亡。
　　4.蓝萼甲素通过抑制UMUC3细胞的PI3K/Akt通路诱导G2/M期阻滞和细胞凋亡。
　　5.蓝萼甲素有可能成为一种通过靶向PI3K/Akt通路治疗膀胱癌的药物。

目录

摘要

前言

第一章 蓝萼甲素抑制人膀胱癌细胞的增殖及克隆形成能力

1．实验材料和方法

2．研究结果

3．讨论

第二章 蓝萼甲素对膀胱癌细胞UMUC3抗肿瘤作用的机制研究

1．实验材料和方法

2．研究结果

3．讨论

第三章 蓝萼甲素对小鼠模型UMUC3移植瘤的影响及机制研究

1．实验材料和方法

2．研究结果

3．讨论

全文总结

参考文献

主要中英文词汇对照表

攻读学位期间成果

致谢

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