基于高通量测序技术的地中海贫血无创产前筛查研究

摘要

目的:
　　地中海贫血是全世界的高发遗传病之一，是人体内的α、β-珠蛋白基因突变或者缺失致珠蛋白肽链失衡引起的溶血性贫血。地中海贫血多发于地中海沿岸国家，我国沿海城市是高发地区，特别是广西、广东、海南、台湾和香港等地，人群携带率约10％。地中海贫血尚无根治的方法，只能靠输血治疗或骨髓移植，但其价格昂贵且不能彻底治愈，因此产前筛查和诊断对预防地中海贫血具有重大意义。目前临床报道产前诊断的取材方法有:绒毛活检、羊膜腔穿刺、脐静脉穿刺，这些有创伤性的操作可能导致孕妇出血、流产或宫内感染等。
　　1997年，卢煜明团队发现孕妇外周血浆中存在来自胎儿的游离DNA，这一发现为无创性产前诊断提供了新的思路。随着高通量测序技术的应用，孕妇血浆游离DNA无创产前检测胎儿非整倍体及部分微缺失/微重复综合征已经广泛应用于临床。基于此类胎儿游离DNA的无创产前诊断更安全，更容易被受试者接受，也避免了获取胎儿物质的创伤性操作导致的风险。鉴于此，本研究拟建立一套安全、准确、无创性地中海贫血产前检测方案。
　　方法:
　　选取中山大学附属第三医院产前诊断中心8个地中海贫血家系，4个为α-地贫携带家系，4个为β-地贫携带家系。抽取夫妇双方外周血、孕妇羊水标本进行DNA提取，使用多重PCR对家系成员基因组DNA进行扩增，扩增区域为HBA基因及HBB基因上下游2Mb的高频变异单核苷酸多态性位点及致病变异位点。α-地中海贫血扩增引物共1354对，β-地中海贫血扩增引物共361对，扩增产物采用半导体高通量测序及生物信息分析。利用父母亲碱基差异的SNP位点进行分类统计，把致病变异位点与SNP位点关联到同一条染色体上构建单倍体型。采集孕妇外周血、分离血浆及提取血浆游离DNA，优化文库构建及靶向捕获体系，减少孕妇血浆用量。血浆游离DNA进行目标靶向捕获，捕获范围为HBA基因及HBB基因上下游2Mb的高频变异单核苷酸多态性位点及致病变异位点，半导体高通量测序后获得母血浆DNA的SNP位点，生物信息分析胎儿父源性遗传单倍体型及母血中单倍体型相对剂量，将血浆cffDNA中SNP的累积数量输入到序贯分类模型中分类，确定母源性遗传单倍体型，最终获得胎儿地中海贫血基因型。孕妇羊膜腔穿刺获得的羊水DNA进行地中海贫血产前诊断的结果与应用母血浆cffDNA进行地中海贫血无创性产前检测的结果进行比对分析，验证本方案的准确性及可行性。
　　结果:
　　1、目标捕获文库浓度大于100pM进行上机测序，数据量可用于生物信息分析，100pM的文库最低血浆量为2ml，全血量为5ml。
　　2、采用父源性母源性碱基差异的SNP位点测序频率计算胎儿浓度，与胎儿Y染色体比例或通过Y染色体拟合计算胎儿浓度趋势一致，差异没有统计学意义(P＞0.05)。
　　3、8例进行无创性地中海贫血检测的家系中，成功推导出所有家系的单倍体型。
　　4、8例进行无创性地中海贫血检测的家系中，通过单倍体型分析、单倍型剂量分析、序贯概率比检验成功推导出所有家系的胎儿地中海贫血基因型。
　　5、通过母血浆游离DNA检测的地中海贫血基因型与侵入性产前诊断结果一致，符合率为100％。
　　结论:
　　建立了一种基于高通量测序技术的地中海贫血无创性产前筛查方案，使高通量测序在遗传病检测领域中应用更全面，更广泛。该方案具有无创伤性、检出率高、灵敏度高等特点，为临床开展其他单基因病无创性产前检测提供技术基础。

目录

摘要

前言

1．地中海贫血分类及基因功能

2．α-珠蛋白基因突变的功能影响

3．β-珠蛋白基因突变的功能影响

4．地中海贫血基因检测方法

5．母体血浆游离DNA的发现及无创性地中海贫血研究的发展

材料与方法

1 研究对象

2 主要仪器与试剂

3 实验方法

结果

1．家系特征

2．血浆使用量的优化结果

3．测序数据分析评估

4．CffDNA中胎儿浓度分析

5．家系的单倍体型构建

6．cffDNA中父源遗传情况分析

7．cffDNA中母源遗传情况分析

8．羊水DNA地中海贫血基因型检测结果

小结

结论

讨论

参考文献

附录

致谢

声明