沉默SLP-2对人宫颈癌细胞迁移、侵袭及增殖能力的影响

摘要

研究目的:
　　宫颈癌是发展中国家女性中发病率第2位及致死率第3位的恶性肿瘤。目前，早期宫颈癌患者治疗后的5年生存率高达90％，而局部晚期或远处转移患者预后仍不理想，特别是Ⅳ期患者的5年生存率仅约20％。尽管以顺铂为基础的同步放化疗可改善局部晚期患者的总生存率和无进展生存期，但约50％局部晚期患者在初始治疗后的2年内出现复发。肿瘤发生转移是宫颈癌进展及治疗失败的重要原因，因此探寻宫颈癌转移及进展的机制，寻找预测宫颈癌发生及进展潜在的新的分子靶点，有着极其重要的临床价值。
　　SLP-2(Stomatin-like protein2/STOML-2)是stomatin基因超家族的新成员。SLP-2与线粒体内膜紧密相连，位于线粒体内膜与外膜之间的膜间隙内。其功能是调节线粒体蛋白质的稳定性，包括呼吸链复合物的抑制肽和亚基。近年来多项研究发现SLP-2参与肿瘤的发生与发展，与肿瘤细胞的增殖、凋亡、粘附及侵袭等密切相关。然而，SLP-2在宫颈癌中的作用及潜在机制目前研究甚少，尤其是SLP-2对宫颈癌侵袭转移的影响目前尚未见报道。我们课题组前期研究发现SLP-2在宫颈癌组织及细胞中高表达，其高表达与宫颈癌的鳞状细胞癌抗原、深肌层浸润、淋巴脉管浸润、盆腔淋巴结转移情况呈正相关，为盆腔淋巴结转移独立的危险因素。由此，我们猜测SLP-2可能参与宫颈癌的转移及进展。有研究发现SLP-2通过诱导肝癌细胞上皮间质转化(EMT)的发生促进肝癌的侵袭及转移。SLP-2是否也通过促进宫颈癌EMT的发生进而促进宫颈癌的侵袭及转移目前尚未见报道。因此本研究对此进行了初步探讨，旨在研究SLP-2对宫颈癌细胞迁移和侵袭能力的影响及可能的机制，为宫颈癌寻找潜在的转移预测标志分子及治疗的新靶点。
　　研究方法:
　　用siRNA转染人宫颈腺癌Hela细胞及宫颈鳞癌Siha细胞作为沉默组，同时设立空白对照组及阴性对照组，用荧光定量PCR、Western blot检测SLP-2蛋白的表达量，用划痕实验、Transwell实验检测沉默SLP-2对Hela和Siha细胞迁移能力的影响，用基质胶Transwell实验检测沉默SLP-2对Hela和Siha细胞侵袭能力的影响，用MTT及细胞克隆形成实验检测沉默SLP-2对Hela和Siha细胞增殖能力的影响，用Western blot检测沉默SLP-2后Hela和Siha细胞上皮间质转化标志分子E-cadherin、β-catenin、vimentin及上皮间质转化上游转录因子Twist蛋白表达量的变化。
　　研究结果:
　　siRNA能够有效下调Hela细胞和Siha细胞中SLP-2的表达;划痕实验显示沉默组的划痕面积愈合率明显下降(P＜0.01);Transwell实验及基质胶Transwell实验均显示沉默组穿过小室膜至下室的细胞数明显减少(P＜0.01);MTT实验及细胞克隆形成实验均显示沉默组的细胞增殖能力明显下降，与对照组相比差异均具有统计学差异;Western blot结果显示沉默组上皮细胞标志分子E-cadherin及β-catenin表达升高，而间质细胞标志分子vimentin表达下降，表明Hela细胞和Siha细胞的上皮间质转化受到抑制;Western blot结果显示沉默组Twist蛋白的表达量也明显下调。
　　研究结论:
　　1.沉默SLP-2可抑制宫颈癌Hela和Siha细胞的迁移及侵袭能力。
　　2.沉默SLP-2可抑制宫颈癌Hela和Siha细胞的增殖能力。
　　3.沉默SLP-2可抑制人宫颈癌Hela和Siha细胞上皮间质转化(EMT)的发生，其作用机制可能与下调Twist蛋白的表达有关。

目录

摘要

1．1 宫颈癌概述

1．2 SLP-2基因概述

1．3 上皮间质转化与肿瘤转移

第二章 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 细胞株

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要耗材

2．1．4 主要仪器和设备

2．2 细胞培养

2．2．1 细胞培养相关试剂的配制

2．2．3 细胞复苏、培养及换液

2．2．4 细胞传代

2．2．5 细胞冻存

2．2．6 细胞计数

2．3 细胞瞬时转染

2．3．1 靶向干扰SIP-2基因的siRNA的合成、保存和使用

2．3．2 细胞瞬时转染实验步骤

2．4 细胞功能实验

2．4．1 细胞划痕实验(wound healing assay)

2．4．2 Transwell迁移实验

2．4．3 Transwell基质胶侵袭实验

2．4．4 MTT实验

2．4．5 细胞克隆形成实验

2．5 蛋白质免疫印迹(Western blot)

2．5．1 主要试剂的配制

2．5．2 细胞的全蛋白提取

2．5．3 蛋白浓度的测定(BCA法)

2．5．4 蛋白质样品的变性及保存

2．5．5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

2．6 实时荧光定量PCR(RT-PCR)

2．6．1 细胞总RNA的提取和浓度测定

2．6．2 逆转录反应

2．6．3 实时荧光定量PCR

2．7 统计学分析

第三章 实验结果

3．2 沉默SLP-2可抑制Hela细胞及Siha细胞的迁移能力

3．2．1 划痕实验结果

3．2．2 Transwell迁移实验结果

3．3 沉默SLP-2可抑制Hela细胞及Siha细胞的侵袭能力

3．4 沉默SLP-2可抑制Hela细胞和Siha细胞的增殖能力

3．5 沉默SLP-2可抑制Hela细胞及Siha细胞的上皮间质转化(EMT)

3．6 沉默SLP-2对EMT上游转录因子Twist的影响

第四章 讨论

全文小结

参考文献

缩略词中英文对照

攻读硕士学位期间研究成果

致谢

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