LIMK1/LIMK2失平衡通过激活WNT/β--catenin通路诱导结肠癌进展及转移的分子机制研究

摘要

结直肠癌(CRC)是我国患病率与死亡率最高的癌症之一，我国结直肠癌年增长速度为8％，是世界平均水平的2倍;2015年新发病例数37.63万，占世界新发病例1/4。结直肠癌是一种异质性的疾病，通常起源于癌前病变。锯齿状腺瘤(SA)是一种具有锯齿状腺窝结构的腺瘤，包括增生性息肉(HP)，无蒂锯齿状腺瘤(SSA/P)，传统锯齿状腺瘤(TSA)，其中以无蒂锯齿状腺瘤癌变率最高。既往已有报道提示Wnt通路激活与锯齿状腺瘤的恶性转变相关。目前，锯齿状腺瘤的癌变机制尚不明确，因此阐明锯齿状腺瘤癌变发生机制，阻止结直肠癌进展，对结直肠癌的“早诊”“早治”具有重要意义。 肿瘤转移是结直肠癌患者死亡的重要原因，结直肠癌的转移是一个多步骤、多阶段、多基因参与的复杂过程。近年来，关于结直肠癌转移的相关研究层出不穷，但是能够用于早期预测转移的肿瘤标志物却很有限，深入研究结直肠癌的发生发展分子机制，在众多因素中寻找有效、敏感、特异的结直肠癌转移分子标志物仍然重要。 LIM激酶家族是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，包括两种激酶，LIMK1和LIMK2。LIMK1与LIMK2结构有50％相同，其中70％的相同结构集中在激酶结构域，因此既往研究推测它们具有相似的功能。在我们过去的研究中，LIM激酶1(LIMKinaSe-1，LIMK1)是一个通过表达谱芯片筛选出来的在发生淋巴结转移的结肠癌组织中表达上调的基因。既往研究已证明LIMK1与肿瘤发生、侵袭和转移密切相关。有趣的是，在我们前期的研究中发现，在结肠癌细胞中，LIMK1高表达的细胞中，LIMK2则表现出下调;LIMK1低表达的细胞中，LIMK2则表现出上调。目前对于LIMK家族的研究主要集中于LIMK1，对于LIMK2的研究较少。在结肠癌中，LIMK2是否与LIMK1具有相同的促进肿瘤发生、侵袭、转移的作用，以及以何种机制导致肿瘤发生有待进一步探讨。 Wnt通路是结直肠癌发生发展过程中一条重要的信号通路，比如调控肿瘤发生与转移。Wnt通路包括经典Writ通路与非经典Wnt通路，其中β-catenin是经典Wnt通路的一个重要调控因子。[β-catenin可作为转录因子，调控下游基因，诸如：MMP7，C-MYC，MET，C-JUN，CD44。目前在结直肠癌研究中，尚未有研究报道LIMK2、LIMK1、β-catenin三者之间的关系及其在结直肠癌发生与转移中作用。 研究目的： 本课题研究目的在于探讨LIMK2对锯齿状腺瘤癌变及结直肠癌转移的作用机理，LIMK2与LIMK1在结直肠癌进展与转移中的关系，为结直肠癌发生发展提供新认识，为LIMK激酶特异性靶向药提供新线索。 研究方法： 1.LIMK2在结直肠癌与结肠腺瘤中表达水平验证 (1).免疫组织化学(IHC)和免疫印迹(western blot)、RT-PCR检测LIMK2在结直肠癌的表达水平。 (2).免疫组织化学验证LIMK2在锯齿状腺瘤的表达水平。 2.LIMK2在结肠癌细胞中的生物学行为探究 (1).体外细胞生物学实验：合成siRNA干扰LIMK2，构建LIMK2过表达质粒，瞬时转染结直肠癌细胞株，通过细胞周期及Transwell、划痕等多个实验进行探讨; (2).体内细胞生物学实验：利用慢病毒细胞株进行裸鼠皮下及脾脏注射，构建皮下成瘤模型及肝转移瘤模型，观察LIMK2异常表达对结直肠癌细胞侵袭能力的影响。 3.LIMK2在结肠癌发生发展中与下游关键基因的调控关系 western blot检测LIMK2异常表达后EMT标志物的变化情况并筛选与LIMK2相关的分子信号通路及基因。 4.LIMK2与LIMK1在结肠癌发生发展中的关联 (1).免疫组织化学、免疫印迹、RT-PCR验证LIMK2、LIMK1在结直肠癌、腺瘤组织中的表达水平; (2).免疫印迹、免疫荧光验证与下游作用蛋白关系。 研究结果： 1.与癌旁组织相比，LIMK2在结直肠癌组织中低表达(P=0.00)。在从正常组织、锯齿状腺瘤、结直肠癌进展过程中，LIMK2表达进行性下降。LIMK2在转移性较低的结直肠癌细胞中SW480，HCT116表达较高，转移性较高的LOVO中表达较低。 2.LIMK2瞬时干扰促进结直肠癌细胞侵袭与迁移，瞬时过表达则抑制结直肠癌细胞侵袭与迁移。LIMK2瞬时干扰促进结直肠癌细胞G1/M期转化，瞬时过表达阻滞结直肠癌细胞G1/M期转化。 3.干扰LIMK2后Ecadhrin表达下降，Vimentin表达升高;过表达LIMK2后Ecadhrin表达升高，Vimentin则出现表达下降，LIMK2可诱导结直肠癌细胞发生EMT转化。 4.低表达的LIMK2促进β-catenin入核，激活下游靶基因MET，C-MYC，C-JUN等转录。 5.在结直肠癌进展中，LIMK1与LIMK2表达具有负相关关系。LIMK1与LIMK2竞争性抑制β-catenin入核。失平衡LIMK1/LIMK2通过Wnt通路促进肿瘤进展。 研究结论： 结直肠癌组织中LIMK2表达下调。低表达LIMK2可通过诱导结直肠癌细胞发生EMT转化促进结直肠癌转移。LIMK1与LIMK2竞争性抑制β-catenin入核，失平衡LIMK1/LIMK2通过激活Wnt通路促进肿瘤恶性演变。

目录

摘要

第一章LIMK2在锯齿状腺瘤、结肠癌中的表达水平

前言

材料方法

结果

讨论

第二章LIMK2对结直肠癌细胞生物学行为的影响

前言

材料方法

结果

讨论

第三章LIMK2抑制结直肠癌发生发展的分子机制探讨

前言

材料方法

结果

讨论

第四章LIMK2与LIMKl相互作用关系的分子机制探讨

前言

材料方法

结果

讨论

参考文献

综述 锯齿状腺瘤研究进展

攻读学位期间所获成果

致谢

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