5-氨基酮戊酸光动力疗法降低人乳头瘤病毒载量临床观察及机制研究

摘要

尖锐湿疣是一种常见的性传播疾病，主要由人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染引起。据统计，美国14-59岁女性，生殖器部位HPV感染率为26.8％[1]而18-59岁男性中，生殖器部位HPV感染率为45.2％[2]。尖锐湿疣的复发很常见。既往研究已经证实5-氨基酮戊酸光动力疗(5-aminolevulinic Acid Photodynamic Therapy,ALA-PDT)是治疗尖锐湿疣的安全有效方法，并且能够有效降低复发率。但作用机制亦尚未完全清楚。
　　目的：
　　1.首先收集尖锐湿疣或生殖器部位HPV感染患者的临床资料，在治疗前，治疗过程中，治疗结束后监测HPV病毒分型载量的变化情况，观察ALA-PDT对HPV病毒分型载量的影响。
　　2.分析尖锐湿疣组织中TAP-1及MHC-Ⅰ类分子的表达情况。
　　3.检测ALA-PDT干预前后HPV病毒蛋白E6/E7变化情况，抗原处理相关转运复合体TAP-1，TAP-2，tapasin表达水平，及MHC-Ⅰ类分子变化情况。探讨ALA-PDT疗法降低尖HPV病毒载量的可能机制。
　　方法：
　　1、5-氨基酮戊酸光动力疗法降低人乳头瘤病毒载量临床观察
　　1.1 5-氨基酮戊酸光动力疗法对尖锐湿疣患者病毒分型载量影响及疗效观察
　　1.1.1 收集2015年12月至2017年10月就诊于南方医院皮肤科的诊断为“尖锐湿疣”的患者，符合纳入排除标准，治疗前签署知情同意书，治疗资料详细，且能够定期随访。
　　1.1.2 监测ALA-PDT治疗前，治疗过程中，治疗后HPV分型载量变化情况。
　　1.1.3 记录患者ALA-PDT治疗过程中出现的不良反应。
　　1.1.4 随访时间至少半年，统计患者复发率。
　　1.2 5-氨基酮戊酸光动力疗法对无症状的HPV感染患者病毒分型载量影响
　　1.2.1 收集2015年12月至2017年10月就诊于南方医院皮肤科的无症状的“HPV感染”的患者，不伴有其他性传播疾病和系统性疾病，就诊资料详细，且能够定期随访。
　　1.2.2 患者治疗前监测HPV病毒载量变化，至少连续2次监测病毒载量持续上升，判断病毒处于活动感染状态，患者行ALA-PDT治疗;若连续2次监测病毒载量逐步下降，提示病毒逐渐被清除，患者不进行治疗，定期观察HPV分型载量。
　　1.2.3 患者行3次ALA-PDT治疗后，统计病毒转阴率。
　　2、抗原处理相关转运体与主要组织相溶性复合体-Ⅰ类分子在尖锐湿疣皮损内的表达
　　2.1 免疫组化方法检测尖锐湿疣组织TAP-1及MHC-1类分子表达情况，Western Blot，RT-PCR技术检测疣体组织与健康对照者包皮组织抗原处理相关转运复合体表达情况。
　　3、ALA-PDT降低人乳头瘤病毒机制研究
　　3.1 人宫颈癌细胞株Siha/Hela由南方医院临床医学实验研究中心提供。培养条件为温度37℃，含5％CO2孵箱中孵育，用含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM（高糖）培养基进行培养。
　　3.2 实验细胞分组：将实验细胞随机分为4组：①空白对照组;②ALA组;③照光组;④ALA-PDT组。
　　3.3 筛选ALA-PDT最佳作用浓度：不同浓度ALA孵育24h后，激光共聚焦显微镜下观察平均荧光强度，635nm红光照射后CCK-8法检测细胞增殖活性。
　　3.4 筛选ALA-PDT最佳光照能量：0.1mmol/L ALA孵育24h后，不同能量635nm红光照射后CCK-8法检测细胞增殖活性。
　　3.5 细胞增殖活性检测：ALA孵育24h后，加入CCK-8试剂，酶标仪检测细胞增殖活性。
　　3.6 HPV病毒蛋白E6/E7检测：Western Blot法检测ALA-PDT处理后HPV病毒E6/E7蛋白表达水平变化。
　　3.7 抗原处理相关转运复合物mRNA检测：RT-PCR法检测ALA-PDT处理后TAP-1，TAP-2及tapasin mRNA表达水平。
　　3.8 TAP-1蛋白检测：Western Blot法检测ALA-PDT处理后TAP-1蛋白表达情况
　　3.9 MHC-Ⅰ类分子检测：流式细胞技术检测ALA-PDT处理后MHC-Ⅰ类分子平均荧光强度。
　　结果：
　　1.ALA-PDT降低HPV病毒载量
　　1.1 ALA-PDT能够降低尖锐湿疣患者病毒载量
　　1.1.1 对于单一型别HPV感染的尖锐湿疣患者3次或6次ALA-PDT治疗后病毒载量与治疗前相比明显降低;多重型别HPV感染患者6次光动力治疗后HPV病毒载量也明显降低，差异有统计学意义。
　　1.1.2 单一感染患者ALA-PDT6次后病毒转阴率明显高于多重感染，差异有统计学意义。因此推测单一型别HPV感染在ALA-PDT治疗过程中病毒更易被清除。
　　1.1.3 光动力治疗过程中，疼痛是最常见的不良反应。大部分患者能够忍受。无严重的系统不良反应。
　　1.1.4 35例患者随访时间半年以上，其中有5例患者复发，复发率为14.28％。
　　1.2 ALA-PDT能够清除无症状HPV感染
　　1.2.1 对于无症状的HPV感染患者，治疗前至少连续2次监测HPV病毒载量，若载量持续上升，提示病毒活动性感染，行ALA-PDT治疗。3次ALA-PDT治疗后病毒载量明显降低，差异有统计学意义。而且与尖锐湿疣患者相比，1次ALA-PDT治疗后，无症状HPV感染患者病毒转阴率更高，差异有统计学意义。因此推测潜伏感染的HPV病毒更容易被清除。
　　2.HPV感染对TAP-1及MHC-Ⅰ类分子表达的抑制作用。
　　免疫组化结果提示，与对照组相比，尖锐湿疣组织中TAP-1，MHC-Ⅰ类分子表达量明显降低，差异有统计学意义。RT-PCR结果提示尖锐湿疣组织中TAP-1，TAP-2，tapasin mRNA表达水平明显低于健康对照者包皮组织，差异有统计学意义。Western-blot结果提示尖锐湿疣组织TAP-1蛋白表达量明显下降，差别有统计学意义。因此HPV感染能够抑制处理抗原相关转运复合体及MHC-Ⅰ类分子表达。
　　3.ALA-PDT降低HPV病毒载量机制研究
　　3.1 不同浓度，不同照光功率ALA-PDT处理后，CCK-8检测增殖活性结果提示：0.1mmol/LALA处理后，增殖活性有所下降，但与对照组比，差异无统计学意义，浓度为0.25、0.5、1、2mmol/L时，增殖活性明显降低，差异有统计学意义(p＜0.001)。0.1mmol/LALA避光孵育24h后的细胞用不同能量0.6J/cm2、1.2J/cm2、2.4J/cm2、3.6J/cm2、4.8J/cm2635nm红光照射后，能量为0.6J/cm2时增殖活性有所下降，与对照组相比，差异无统计学意义。照光剂量为1.2J/cm2时，细胞增殖活性明显下降，差异有明显统计学意义(p＜0.001)。照光剂量增加到2.4、3.6、4.8J/cm2细胞增殖活性也明显下降(p＜0.001)。因此后续实验采用ALA浓度为0.1mmol/L，照光能量为0.6J/cm2。
　　3.2 ALA-PDT能够抑制HPV病毒E6/E7蛋白表达
　　Western blot结果显示，与空白对照组，ALA组，照光组相比，ALA-PDT组细胞HPV E6/E7蛋白表达量明显降低，差别有统计学意义。
　　3.3 ALA-PDT能够升高抗原处理相关转运复合物mRNA表达水平
　　RT-PCR结果显示，与对照组相比，ALA-PDT组细胞TAP-1，TAP-2mRNA表达水平明显上升，差别有统计学意义。
　　3.4 ALA-PDT能够诱导TAP-1蛋白表达升高
　　Western blot结果显示，与空白对照组，ALA组，照光组相比，ALA-PDT组细胞TAP-1表达水平明显上升，差异有统计学意义。
　　3.5 ALA-PDT使MHC-1类分子表达水平升高
　　流式细胞技术检测结果提示与空白对照组，ALA组，照光组相比ALA-PDT组MHC-Ⅰ类分子平均荧光强度升高，差异有统计学意义。
　　结论：
　　本文的研究证实，ALA-PDT不仅能够降低尖锐湿疣患者HPV病毒载量，减少复发率，而且能够使无症状HPV感染者病毒转阴。动态监测HPV病毒分型定量能够判断HPV感染状态，能够更好的指导光动力治疗。HPV感染能够抑制TAP-1及MHC-Ⅰ类分子表达水平，而ALA-PDT能够降低这种抑制作用，使TAP复合物及MHC-Ⅰ分子表达水平升高，同时抑制HPV病毒E6/E7蛋白表达从而使HPV病毒载量降低，减少尖锐湿疣患者复发率。

目录

摘要

前言

第一章 5-氨基酮戊酸光动力疗法降低人乳头瘤病毒型载量的临床观察

1．材料

2．方法

3．结果

4．结论

5．讨论

第二章 抗原相关转运体与主要组织相溶性复合体-Ⅰ类分子在尖锐湿疣皮损内表达的研究

1．材料

2．方法

3．结果

4．结论

5．讨论

第三章 ALA-PDT下调HPV E6／E7蛋白表达同时上调抗原相关转运复合体-MHc-Ⅰ类分子表达的研究

1．材料

2 方法

3．结果

4．结论

5．讨论

全文总结

参考文献

综述

攻读博士期间发表文章

全文主要缩略语

致谢

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