幽门螺杆菌转基因樱桃番茄口服疫苗的初步研究

摘要

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染是造成胃肠道疾病如慢性胃炎、消化性溃疡以及胃癌的直接原因。本研究通过构建融合表达载体,优化樱桃番茄(Lycopersivon esculentum Mill.)‘黄樱桃-2号’再生培养和遗传转化体系,利用农杆菌介导的叶盘转化法将融合基因转入樱桃番茄子叶中,以期为生产幽门螺杆菌转基因樱桃番茄口服疫苗打下基础。
　　构建CHE8-2391Z、CHE8-HpaA-eLTB以及CHE8-UreB-eLTB融合表达载体,并优化抗原表达策略。通过观察不同激素配比下樱桃番茄子叶愈伤组织和不定芽诱导以及生根情况对樱桃番茄再生体系进行优化。通过筛选最适的农杆菌侵染浓度、卡那霉素筛选浓度以及头孢霉素、羧苄青霉素除菌浓度对樱桃番茄遗传转化体系进行优化。在获得PCR阳性转基因植株后,利用real-time PCR(qPCR)对樱桃番茄基因组中外源基因新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)、β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)以及幽门螺杆菌粘附素基因(hpaA)的整合拷贝数进行探究。利用 RT-PCR在转录水平检测转基因樱桃番茄果实中外源基因的表达情况。提取樱桃番茄果实的可溶性总蛋白,SDS-PAGE检测外源蛋白表达情况。最后通过TTC染色对非转基因植株、CHE8-2391Z转基因植株以及 CHE8-HpaA-eLTB转基因植株进行花粉活力对比,初步探究转基因樱桃番茄坐果率低的原因。具体结果如下:
　　1.成功构建CHE8-2391Z、CHE8-HpaA-eLTB以及 CHE8-UreB-eLTB表达载体。
　　2.分别获得 CHE8-2391Z、CHE8-HpaA-eLTB以及 CHE8-UreB-eLTB转化植株23、21以及3株。
　　3.樱桃番茄子叶愈伤组织和不定芽诱导最适培养基为:MS+2.5 mg/L6-BA+0.2 mg/L IAA,出愈率和出芽率分别达到100％和96.83%。最适生根培养基为:1/2 MS+0.2 mg/L IAA。
　　4.农杆菌侵染浓度为OD600≈0.4时,樱桃番茄子叶的抗性愈伤率最高。确定卡那霉素筛选浓度为50 mg/L,头孢霉素和羧苄青霉素除菌浓度均为200 mg/L。
　　5.经 PCR检测呈阳性的CHE8-2391Z、CHE8-HpaA-eLTB以及 CHE8-UreB-eLTB转基因植株分别有8、4以及0株。其中,在CHE8-HpaA-eLTB转基因植株果实中检测到外源基因转录水平的表达。
　　6.real-time PCR结果表明,外源基因在转基因植株内整合的拷贝数为0-20不等,4株为PCR假阳性。80%的转基因植株发生了基因重排现象。
　　7.转基因和非转基因植株的花粉活力存在差异,非转基因植株、CHE8-2391Z转基因植株以及 CHE8-HpaA-eLTB转基因植株的花粉活力分别为:31%、4%和45.45%。
　　本研究优化了樱桃番茄‘黄樱桃-2号’的再生体系和遗传转化体系,这为进一步挖掘樱桃番茄作为转基因植物受体材料的巨大潜力提供基础。而得到的CHE8-HpaA-eLTB单拷贝转基因植株,能为后续开展转基因樱桃番茄口服疫苗的免疫原性研究奠定基础。通过qPCR双标准曲线法对樱桃番茄中外源基因整合拷贝数进行探究,排除了番茄抗坏血酸过氧化物酶基因(apx)作为樱桃番茄单拷贝内参基因的可能性。

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1. 前言

1.1 幽门螺杆菌的危害及现阶段治疗方法的局限

1.2 转基因植物疫苗的应用与前景

1.3 幽门螺杆菌转基因番茄简介

1.4 本研究的目的及内容

2. 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3. 实验结果

3.1 载体构建

3.2 载体检测结果

3.3 樱桃番茄再生体系的建立

3.4 樱桃番茄转化体系的建立

3.5 樱桃番茄转化植株分子鉴定结果

3.6 转基因植株外源基因拷贝数检测

3.7 转基因樱桃番茄可溶性蛋白检测

3.8 转基因樱桃番茄植株花粉活性研究结果

4. 讨论

4.1 载体构建

4.2 ‘黄樱桃-2号’樱桃番茄的再生体系

4.3 ‘黄樱桃-2号’樱桃番茄的遗传转化体系

4.4 外源基因整合拷贝数

4.5 外源蛋白表达

4.6 花粉活力比较

4.7 本研究创新性

5. 结论与展望

附录

在校期间发表论文情况

参考文献

致谢