ROS-ERK-PGE2信号通路调节皮肤损伤后早期炎症反应

摘要

研究背景和目的:
　　创伤愈合是一个复杂的过程,包括炎症反应、细胞增殖和组织重建三个互相重叠的阶段。损伤自身作为一个信号启动修复机制至愈合完成。传统的观念认为创伤后首先启动的是止血过程,继之炎症细胞先后趋化至创面局部,参与创伤修复中的炎症反应。但最近研究发现活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)在调节创伤后早期炎症反应中具有重要的作用,ROS依赖的氧化还原系统是启动创伤修复级联反应中必不可缺的环节,ROS可以作为第二信使参与调节信号转导及调节基因表达等作用。
　　创伤后早期炎症反应的主要炎症介质有5-羟色胺及前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)等,其中创伤局部的红、肿、热、痛主要与PGE2的产生相关。但创伤后PGE2快速升高的分子机制目前仍然不清。因此,本研究拟采用体外人皮肤角质细胞机械损伤模型,观察角质细胞损伤后ROS的产生,探讨ROS下游及上调PGE2上游的信号通路,试图阐明ROS介导的信号途径在创伤修复中早期炎症反应的作用机制。
　　第一部分、皮肤角质细胞损伤后升高的ROS上调PGE2
　　目的:研究人皮肤角质细胞机械损伤ROS生成增加对PGE2分泌的影响。
　　方法:
　　1、体外培养人皮肤角质细胞至第3-8代,利用该细胞建立机械损伤模型;
　　2、将人皮肤角质细胞分为三组:
　　a)单纯损伤组(接受机械损伤组);
　　b)Nox抑制剂(DPI)预处理+损伤组;
　　c)无处理组(对照组);
　　3、机械损伤后0、1、5、10、15、30、60min收集细胞样本,荧光探针技术检测各组细胞ROS的生成;
　　4、机械损伤后0、1、2、4、6、8、12、24h收集各组细胞上清液,EIA法检测PGE2含量的变化。
　　结果:
　　1、在建模后不同时间点,损伤组人皮肤角质细胞ROS生成明显高于对照组,在损伤后1min开始有ROS生成,30min时点达到峰值(P<0.05)。
　　2、机械损伤后人皮肤角质细胞分泌PGE2量明显升高,在损伤后6h抵达高峰(P<0.05);机械损伤后24h PGE2量仍明显高于对照组(P<0.05)。
　　3、使用DPI抑制Nox活性可明显减少机械损伤2h或4h后人皮肤角质细胞内PGE2的分泌量(P<0.05)。
　　结论:机械损伤可导致人皮肤角质细胞分泌PGE2明显增多,这与损伤后胞内ROS含量的升高和Nox酶活性的升高密切相关。
　　第二部分、皮肤角质细胞损伤后ROS通过活化ERK信号上调PGE2
　　目的:探讨皮肤角质细胞损伤后ERK信号是否参与调节ROS介导的PGE2生成。
　　方法:
　　1、体外培养人皮肤角质细胞至第3-8代,利用该细胞建立机械损伤模型;
　　2、将人皮肤角质细胞分为四组:
　　a)单纯损伤组(机械损伤组);
　　b)Nox抑制剂(DPI)预处理+损伤组;
　　c)ERK抑制剂(PD98059)预处理+损伤组;
　　d)无处理组(对照组);
　　3、机械损伤后0、0.25、0.5、1、2、4、6h收集样本,western blot检测各组细胞ERK、p-ERK的生成;
　　4、各浓度Nox抑制剂DPI预处理细胞后进行划痕损伤,30min收集样本,western blot检测各组细胞p-ERK的生成;
　　5、使用PD98059抑制ERK活性后进行划痕损伤,2h、4h收集各组细胞上清液,EIA法检测PGE2含量的变化。
　　结果:
　　1、机械损伤后ERK磷酸化明显增多,在15min时磷酸化最为明显(p<0.05),且在1h后恢复到正常水平。
　　2、各浓度DPI预处理组人皮肤角质细胞p-ERK表达均低于单纯损伤组,其中DPI为10umol/L时,p-ERK显著下降(p<0.05)。DPI为1umol/l及5umol/l时,其p-ERK表达高于对照组(p<0.05)。
　　3、PD98059预处理皮肤角质细胞,于损伤后2h、4h收集细胞上清液,损伤组上清中PGE2的质量浓度较对照组显著升高(p<0.05),PD98059预处理组产生PGE2均较损伤组显著降低(p<0.05)。
　　结论:皮肤角质细胞损伤后ERK信号被活化,激活的ERK信号参与调节 ROS上调PGE2。
　　第三部分、ROS/ERK通过COX-2上调PGE2参与损伤后早期炎症反应
　　目的:探讨参与皮肤角质细胞损伤后炎症反应的信号通路及分子机制。
　　方法:
　　1、体外培养人皮肤角质细胞至第3-8代,利用该细胞建立机械损伤模型;
　　2、将人皮肤角质细胞分为五组:
　　a)单纯损伤组(机械损伤组);
　　b)Nox抑制剂(DPI)预处理+损伤组;
　　c)ERK抑制剂(PD98059)预处理+损伤组;
　　d)COX-2抑制剂(NS398)预处理+损伤组;
　　e)无处理组(对照组);
　　3、机械损伤后0、1、2、4、6、8h收集样本,western blot检测各组细胞COX-2的生成;
　　4、各浓度DPI、PD98059预处理细胞后进行划痕损伤,2h收集样本,western blot检测各组细胞COX-2的生成;
　　5、使用NS398抑制COX-2活性后进行划痕损伤,2h、4h收集各组细胞上清液,EIA法检测PGE2含量的变化。
　　结果:
　　1、机械损伤后COX-2蛋白表达水平呈逐渐增多的趋势,至2h COX-2表达水平升至最高(p<0.05),且观察到在损伤后24h其含量仍比未损伤时升高。
　　2、各浓度DPI+损伤组人皮肤角质细胞COX-2的含量均低于损伤组(p<0.05),其中DPI为10umol/L时,COX-2含量显著被移植下降(p<0.05)。
　　3、各浓度PD98059预处理组中人皮肤角质细胞COX-2的含量均低于损伤组(p<0.05),其中PD98059为30umol/L时,COX-2含量显著下降(p<0.05)。
　　4、NS398预处理皮肤角质细胞,于损伤后2h、4h收集细胞培养上清液,损伤组上清中PGE2的质量浓度较对照组显著升高(p<0.05),NS398预处理组产生PGE2均较损伤组显著降低(p<0.05)。
　　结论:ROS/ERK通过上调 COX-2蛋白含量调节 PGE2的生成,ROS-ERK-COX-2/PGE2信号途径参与了机械损伤后炎症反应。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

前言

第一部分 皮肤角质细胞损伤后升高的ROS上调PGE2

实验材料和方法

1 材料

2 实验方法

实验结果

3.1 人皮肤角质细胞的形态及机械损伤模型的建立

3.2 机械损伤对人皮肤角质细胞ROS生成的影响

3.3 机械损伤对人皮肤角质细胞PGE2分泌的影响

3.4 ROS介导机械损伤后PGE2的生成

讨论

第二部分 皮肤角质细胞损伤后ROS通过活化ERK信号上调PGE2

材料与方法

1 材料

2 方法

实验结果

3.1人皮肤角质细胞机械损伤后ERK磷酸化明显增加

3.2 ROS介导人皮肤角质细胞机械损伤后ERK的活化

3.3 ERK信号介导人皮肤角质细胞损伤后PGE2的产生

讨论

小结

第三部分 ROS/ERK通过COX-2上调PGE2参与损伤后早期炎症反应

材料与方法

1 材料

2 方法

实验结果

3.1 人皮肤角质细胞机械损伤后COX-2蛋白表达及活性明显增加

3.2 ROS介导人皮肤角质细胞机械损伤后COX-2的产生

3.3 ERK通路介导人皮肤角质细胞机械损伤后COX-2的产生

3.4 COX-2介导人皮肤角质细胞损伤后PGE2的产生

讨论

结论

参考文献

中英文缩略词对照表

攻读期间所获成果

致谢